快速PCR方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究

该研究依据哈蟆油Cyt b基因155位SNP位点设计位点特异性PCR引物,采用碱裂解法提取基因组DNA,2步循环PCR程序进行PCR反应,并对PCR反应条件进行优化,从而建立起一种哈蟆油及其4种常见混伪品的快速PCR鉴别方法。该方法在90℃变性3 s,62℃退火延伸20 s进行32个循环时,加入2μL 100×SYBR GreenⅠ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光。该方法准确、简便,40 min内即可完成鉴别,为哈蟆油药材现场快速鉴定提供技术支持。     

蓝菜1号特征特性及标准化栽培技术

蓝菜1号为菘蓝与甘蓝型油菜经体细胞杂交后,通过与油菜连续回交获得的包含有两条相同菘蓝异源染色体,采用组织培养方法继代的二体异附加系;其叶片对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)表现出一定的体外抑制作用。本研究通过示范栽培实践,介绍了该品种的特征特性及其标准化栽培技术要点。     

一种对猪苓生产具有潜在危害的甲虫分子生物学和形态学鉴定

目的 对宁陕县猪苓栽培过程中影响猪苓产量的一种鞘翅目有害昆虫进行分子鉴定和形态学鉴定,确定害虫的种类。方法 对宁陕县减产猪苓栽培地块昆虫进行采集,使用分子生物学鉴定方法对幼虫和成虫进行DNA提取、细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列扩增、测序及BLAST分析,同时使用形态学鉴定方法观察成虫头部下颚、下唇、复眼、触角和结节数量,比对鉴定其种属。结果 成虫和幼虫的分子生物学鉴定结果表明,在进化关系上该虫与鞘翅目中华大扁锹Serrognathus platymelus Saunders的COⅠ序列进化关系最为接近;成虫形态学鉴定结果表明,该虫的雄性头部、胸部、腹部及外生殖器的特征与鞘翅目中华大扁锹吻合;综合判定,该虫为鞘翅目中华大扁锹。结论 鞘翅目中华大扁锹虫害发生可能是导致猪苓产量降低的重要原因,成虫将卵产在朽木内,孵化的幼虫以朽木为食,导致猪苓共生蜜环菌的生长受到抑制,同时幼虫以幼嫩的白苓为食,导致猪苓减产。因此,在猪苓的栽培中应注意该害虫的防治。     

多基原九里香药材的多重位点特异性PCR鉴别

目的 建立一种同时鉴别九里香药材两基原九里香Murraya exotica和千里香M. paniculata的DNA分子鉴别方法。方法 通过比较九里香、千里香的叶绿体基因组序列差异,根据叶绿体基因组上的单核苷酸多态性（SNP）变异位点分别设计九里香和千里香的特异性鉴别引物P03和P04,对影响聚合酶链式反应（PCR）结果的退火温度、循环次数、引物浓度比进行优化,建立了九里香和千里香的多重位点特异性PCR鉴别方法,并对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性考察和适用性考察。结果 在该多重位点特异性PCR鉴别方法中,当PCR反应循环数为31次,退火温度为60 ℃,九里香P03和千里香P04引物比为1∶2时,九里香可获得约330 bp的特异性条带,千里香可得到约230 bp的特异性条带,不同来源的九里香和千里香样品使用建立的多重位点特异性PCR鉴别方法均可获得一致结果。结论 该文建立一种快速、准确鉴别九里香药材基原的多重位点特异性PCR鉴别方法,可在单次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别九里香和千里香。     

蒿属外来药用资源中亚苦蒿的特异性PCR鉴别

目的 基于特异性聚合酶链式反应（PCR）建立了一种中亚苦蒿药材的鉴别方法,可以准确、便捷地鉴别中亚苦蒿及其近缘种。方法 利用Chloroplast Genome Information Resource（CGIR）数据库查找中亚苦蒿及其近源种叶绿体基因组序列,并筛选获得中亚苦蒿特异性单核苷酸多态性（SNP）位点,根据SNP位点设计一对中亚苦蒿特异性鉴别引物zykh1-F和zykh1-R。采集中亚苦蒿及其常见近缘种的原植物样本,建立中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法并优化反应体系,对该方法进行耐受性和适用性考察。利用该方法对从新疆药材市场购买中亚苦蒿药材样本进行鉴别。结果 中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法采用鉴别引物zykh1-F和zykh1-R,退火温度为54 ℃、循环次数为33次。经PCR扩增和凝胶电泳后中亚苦蒿在210 bp处可观察到单一明亮条带,其余近缘种如艾、黄花蒿、白叶蒿、野艾蒿均无条带。结论 该研究所建立的中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中亚苦蒿及其常见近缘种,具有高度特异性,且该方法节约时间和成本,为中亚苦蒿资源引种和利用提供一种方便快捷的物种鉴别方法。     

一株适合红天麻伴栽的蜜环菌菌株筛选

为了筛选适宜红天麻伴栽的蜜环菌菌株,该研究通过对不同产区伴栽天麻的蜜环菌菌株的分离鉴定、蜜环菌菌株的生长特征比较及伴栽天麻实验,筛选出了1株适宜红天麻伴栽的高卢蜜环菌菌株。收集4个天麻产区伴栽天麻使用的菌材,分离菌材上的蜜环菌菌株(G、Y、S、H),采用形态学鉴定与系统发育树相结合的方法,对蜜环菌菌株进行鉴定,确定栽培天麻常用的蜜环菌菌株种类;基于课题组的前期研究对蜜环菌菌株蔗糖酶基因型进行鉴定,以确定蜜环菌菌株的基因型特征;通过对蜜环菌菌株菌索生长速度、直径、干重及多糖含量的测定确定蜜环菌菌株的生长特征;结合蜜环菌菌株的生物学特性和蔗糖酶基因型特征,选择了2株不同的菌株进行天麻伴栽实验,测定天麻产量、天麻素和对羟基苯甲醇含量,筛选出最适合红天麻伴栽的菌株。该研究发现4株蜜环菌菌株均为高卢蜜环菌Armillaria gallica;同一蔗糖酶基因型的菌株G、H菌索总长度、生长速度、直径、分支数、干重和多糖含量均高于同一蔗糖酶基因型的菌株S、Y;分别使用菌株H、S伴栽天麻,发现使用生长速度更快、分支数更多的菌株H伴栽天麻的产量为6.528 kg·m^-2、天麻素和对羟...     

基于特征蛋白的僵蚕配方颗粒鉴定方法

目的:为保障临床用药的安全性和有效性,建立僵蚕配方颗粒的鉴定方法。方法:采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分离不同加工方式的僵蚕样品蛋白,对提取方法、缓冲液pH、料液比、反应温度、反应时间、专属性、适应性进行考察。同时利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)分析寻找稳定且丰度较高的蛋白作为鉴定僵蚕配方颗粒的蛋白标志物。结果:SDS-PAGE最佳提取条件为取僵蚕样品适量,按料液比1∶10加入0.1 mol·L^(–1) NaAc缓冲液(pH=5),30℃振荡提取1.5 h。可分离出特征性条带约40~50 kDa,该条带主要为僵蚕基原动物家蚕Bombyx mori Linnaeus的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、抗糜蛋白和抗胰蛋白等,可作为僵蚕鉴别的蛋白标记。根据SDS-PAGE分析条带的相对分子质量大小、蛋白在僵蚕药材和提取物中的特异性和稳定性,确定Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂为鉴定僵蚕配方颗粒的特异性蛋白。结论:基于差异蛋白建立了可用于僵蚕配方颗粒生成过程的质量控制、僵蚕配方颗粒的SDS-PAGE蛋白鉴定的指纹图谱方法。     

特异性PCR鉴别蜈蚣及其混伪品

目的:蜈蚣是我国传统的中药材,具有良好的药用价值。目前市场上蜈蚣的混伪品日益增多,临床用药的安全性和有效性难以保证。该研究建立了一种蜈蚣基原物种的特异性聚合酶链式反应(PCR)方法,以准确、简便的鉴别蜈蚣及其常见混伪品。方法:通过比较蜈蚣及其混伪品基原物种的COI基因序列差异,根据变异位点设计蜈蚣正品少棘巨蜈蚣的特异性鉴别引物WG-500.F和WG-500.R,采集蜈蚣原动物样本及药材样本,优化反应体系并对此方法进行耐受性和适用性的考察和验证。结果:少棘巨蜈蚣原动物样本及蜈蚣正品药材使用设计的蜈蚣鉴别引物经PCR扩增和凝胶电泳后出约500 bp的单一明亮条带,其他混伪品如多棘蜈蚣、模棘蜈蚣、哈氏蜈蚣、海南蜈蚣等均无条带出现。结论:PCR鉴别方法可准确鉴别蜈蚣原动物和药材的真伪,具有高度特异性,为中药材蜈蚣的真伪鉴别提供了良好的科学依据。该方法具有简单、直观等特点,有利于广泛的普及与应用,在中药材鉴定方面有着广阔的应用前景。     

5-氮杂胞苷影响LjFNS Ⅱ1.1和LjFNS Ⅱ2.1催化金银花木犀草素和木犀草苷合成机制的研究

该研究通过对金银花叶片进行不同时间(1,2,3 d)与不同浓度(20,40,60,80,100μmol·L-1)的5-氮杂胞苷处理,探索5-氮杂胞苷影响黄酮合酶FNSⅡ催化木犀草素和木犀草苷合成的机制。首先对Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1进行克隆;其次UPLC-MS/MS测定金银花叶中木犀草素与木犀草苷的含量,以及Real-Time PCR分析Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1的表达水平,结果表明Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1基因的表达水平与木犀草素的含量变化趋势大体一致,但与木犀草苷的含量变化相关性不显著;同时发现二者之间的表达水平略有差异。研究结果表明,5-氮杂胞苷处理金银花叶片后,Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1的表达水平上升,从而调控木犀草素和木犀草苷的含量升高,为研究Lj FNSⅡ1.1,Lj FNSⅡ2.1催化木犀草素和木犀草苷合成机制提供技术支撑和理论基础。     

天山雪莲鲨烯合酶SiSQS1和SiSQS2调控β-谷甾醇合成机制研究

目的通过比较天山雪莲Saussurea involucrata细胞中鲨烯合酶Si SQS1和Si SQS2的位点变异、蛋白原核表达及表达水平差异以及下游产物β-谷甾醇量的高低,探索天山雪莲细胞Si SQS1和Si SQS2催化β-谷甾醇合成的机制。方法从天山雪莲细胞中克隆出β-谷甾醇生物合成途径上关键酶Si SQS1与Si SQS2基因,并对其进行生物信息学分析;分别对Si SQS1和Si SQS2进行原核表达与条件优化,比较二者在天山雪莲细胞中的蛋白原核表达差异;采用RT-PCR技术对二者在天山雪莲三色系细胞中的表达水平进行比较,采用GC-MS对雪莲三色系细胞中β-谷甾醇进行定量分析,并对β-谷甾醇量与Si SQS1、Si SQS2表达水平做相关性分析。结果 Si SQS1和Si SQS2在242E/D存在残基变异,原核表达及条件优化实验表明二者都有目的蛋白条带出现,但二者之间的原核表达最适体系不同;化学定量与基因表达水平的相关性分析表明β-谷甾醇量与Si SQS1、Si SQS2基因表达水平呈正相关,相关系数分别为0.92和0.89。结论 Si SQS1与Si SQS2二者242E/D残基变异可能影响Si SQS蛋白的表达,二者在催化活性以及对β-谷甾醇积累调控作用上可能存在一定的功能差异,为研究鲨烯合酶SQS调控天山雪莲细胞β-谷甾醇积累的机制提供了技术支持和奠定了理论基础。