大鼠嗅上皮神经干细胞的分离及培养

目的：从新生及成年大鼠嗅上皮分离培养嗅上皮神经干细胞（NSC）,研究其增殖及分化特性。方法：采用含10％胎牛血清的DMEM／F12（1：1）培养液,分离、培养生后第3天和硫酸锌原位创伤后6d的成年大鼠嗅上皮NSC,应用间接免疫荧光染色鉴定培养的NSC及分化的特异性神经细胞类型,四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定嗅上皮NSC的生长曲线及生长因子的影响。结果：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮分离、培养出巢蛋白免疫反应阳性而细胞角蛋白免疫反应阴性,并能分化为神经元和星形胶质细胞的NSC。生后第3天和成年大鼠嗅上皮NSC生存能力的差异无统计学意义（P〉O．05）,细胞克隆形成率为0．05％～0．10％。碱性成纤维细胞生长因子可以显著促进嗅上皮NSC的增殖。结论：从生后第3天和成年大鼠嗅上皮可培养出具有自我复制和多向分化潜能的NSC。     

miR-182可以促进耳蜗前体细胞分化为毛细胞

目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用血清诱导分化,BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力;myosinⅦa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其是否具有分化为毛细胞的潜能。分别利用miR-182 mimics和siRNA在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182,然后在细胞诱导分化7天后,用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例,用Western-blot检测支持细胞标志分子中Sox2的变化。结果使用miR-182 mimics进行过表达后,耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例显著高于对照组,使用miR-182 siRNA进行低表达后此比例显著低于对照组。Western-blot检测显示,Sox2在miR-182 mimics组较对照组降低,miR-182 siRNA组较对照组增加。结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化,ox2可能是此过程中的靶基因。     

“辨状论质”看中药材苦杏仁走油

通过苦杏仁走油前后的质量比较,探讨苦杏仁走油变质现象的感官判别及其物质内涵。该研究对苦杏仁样品走油前后的脂肪油含量、酸值、过氧化值进行了测定,并采用HPLC,GC-MS分别检测了苦杏仁苷、苦杏仁脂肪酸等。利用电子感官仪器(色度仪、电子鼻)量化并对比苦杏仁样品走油前后的颜色、气味;同时与上述结果作相关性分析。结果显示苦杏仁走油后颜色由黄白变棕黄,出现酸味;苦杏仁苷含量下降,酸值、过氧化值显著增高,脂肪酸成分发生变化;药材的外表特征与内在质量的变化具有显著相关性。"感官分析-质量鉴别系统"能为预测中药化学成分的含量、初步判断中药优劣及质量实时监测提供一定科学依据;为中药贮藏的"事先预测、事中干预、事后鉴别"提供新的思路与参考。     

建立大鼠骨髓源性树突状细胞体外扩增及纯化的方法

目的:目前对树突状细胞的研究主要集中在人及小鼠系统,关于大鼠树突状细胞特性和功能的研究较少。体外扩增并纯化大鼠骨髓树突状细胞的方法,并对其进行形态学和免疫学鉴定。方法:实验于2004-06/2005-06在第四军医大学西京医院耳鼻喉科实验室完成。实验材料:8～12周龄雌性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。实验方法:①参考Oliver方法,利用黏附法诱导分离SD大鼠骨髓细胞,获得高纯度的树突状细胞。采用扫描电镜和透射电镜观察培养6,8,10,12 d与12 d加内毒素情况下细胞形态,并采用流式细胞仪鉴定。②无菌条件下取出大鼠脾脏加RPMI1640培养液研磨并通过不锈钢筛网,收集未贴壁细胞,以RPMI1640培养液冲洗出的细胞作为反应细胞。取96孔培养板加入反应细胞,并按照1∶480,1∶240,1∶120,1∶60比例加入刺激细胞。采用ELX800型酶联免疫检测仪测定波长为490 nm处吸光度值。结果:①随培养时间的增长,细胞逐渐成熟,培养12 d的细胞形态不规则,表面有大量树突状突起,培养12 d加内毒素的细胞进一步成熟,体积增大,高表达CD80、CD86分子。②随着培养时间和树突状细胞数目的增加,树突状细胞刺激T细胞增殖的能力逐渐增强,加入内毒素后这种能力进一步加强。结论:成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓树突状细胞方法,并可在培养过程中收获不同成熟状态树突状细胞。     

C57BL／6-gfp小鼠嗅球NSC培养及定位注射方法的建立

目的建立一套稳定的绿色荧光蛋白转基因小鼠（C57BL／6-gfp）嗅球神经干细胞（NSC）体外培养的方法,并初步应用于定位注射试验,为干细胞移植治疗神经性耳聋的实验研究奠定基础。方法培养C57BL／6-gfp小鼠胚胎嗅球NSC,传代并进行分化实验,鉴定后将其立体定位注射于大鼠耳蜗核。结果所培养的NSC生长良好,可稳定传代,能够分化为三种神经细胞。定位注射后可在局部见到绿色荧光阳性的细胞团。结论该方法培养的C57BL／6-gfp小鼠胚胎嗅球NSC可稳定传代并可作为荧光标记细胞进行移植试验。     

噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障通透性的影响

目的研究噪声对豚鼠耳蜗血管纹紧密连接蛋白claudin-5表达及血迷路屏障功能的影响。方法40只豚鼠随机分为正常对照组(20只)和噪声暴露组(20只),噪声暴露组给予声强为115dB SPL白噪声暴露,每天6小时,连续两天,对照组不予噪声暴露。于实验前及噪声暴露后次日对两组豚鼠行ABR检测,第二次ABR检测后对两组豚鼠耳蜗基底膜行鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素(Phalloidin-FITC)染色;用硝酸镧透射电镜和常规透射电镜观察两组豚鼠内耳血迷路屏障通透性和紧密连接的变化;Western blot和免疫组织化学染色观察两组豚鼠耳蜗血管纹和螺旋韧带处claudin-5的表达。结果噪声暴露组豚鼠ABR波Ⅲ反应阈较正常对照组阈移40dB以上,差异有统计学意义(P<0.05);基底膜铺片FITC染色示噪声暴露组底回基底膜毛细胞大量缺失,其余部分毛细胞纤毛排列紊乱并出现融合,而对照组毛细胞排列整齐,其纤毛呈V或W型,两组间外毛细胞计数比较差异有统计学意义(P<0.05);透射电镜下,可见噪声暴露组血管内皮细胞间和边缘细胞间的紧密连接均遭到破坏,细胞间隙增大;硝酸镧透射电镜下,大量镧颗粒从血管腔内渗漏到管腔外的组织间隙,而对照组镧颗粒仅局限于血管腔内;Western blot结果示,两组耳蜗外侧壁血管纹均有claudin-5表达,但噪声暴露组的表达量明显低于正常组;免疫组织化学染色也表明,两组豚鼠耳蜗外侧壁毛细血管内皮细胞、边缘细胞等处均有claudin-5阳性表达,但噪声组表达量显著低于正常组(P<0.05)。结论噪声通过下调紧密连接蛋白claudin-5的表达,破坏细胞间紧密连接,增加豚鼠血迷路屏障的通透性,从而导致内耳微环境的破坏,是噪声性聋可能的发病机制之一。     

噪声对小鼠耳蜗外侧壁缝隙连接蛋白Connexin31表达的影响

目的观察噪声性聋小鼠耳蜗外侧壁缝隙连接蛋白Connexin31(Cx31)表达的变化。方法选用成年雄性Balb/c小鼠44只,随机分为噪声组和对照组,每组22只。两组小鼠均在实验前检测听性脑干反应(ABR),随后应用声刺激器给予噪声组小鼠高强度白噪声(115dB SPL,6h/d,共2天),并在噪声暴露结束后1h再检测噪声组小鼠ABR。对照组不予噪声刺激。于噪声暴露后4h,每组各取4只小鼠耳蜗做冰冻切片,其余18只小鼠提取耳蜗外侧壁组织总RNA,通过免疫荧光染色法观察小鼠耳蜗外侧壁Cx31蛋白的表达,荧光实时定量PCR检测小鼠耳蜗外侧壁Cx31mRNA的表达。结果对照组小鼠耳蜗螺旋韧带可见Cx31特异性荧光,血管纹处未见阳性荧光;噪声组小鼠耳蜗外侧壁免疫荧光染色阳性反应较对照组减弱,Cx31mRNA表达量明显低于对照组。结论噪声能下调Cx31在小鼠耳蜗外侧壁组织的表达,Cx31可能参与了噪声性聋的发病机制。     

树突状细胞参与中耳炎内耳免疫反应的实验研究

目的探讨树突状细胞(DCs)是否及通过何种途径参与内耳的免疫应答,分析中耳炎免疫引发的内耳免疫对内耳功能的影响。方法将Hoechst33342标记的DCs分别经由脑脊液,颈外静脉及颈部皮下注入豚鼠体内,并在无菌条件下于右耳经鼓膜注射1×108L-1的金葡菌液100μL,左耳作正常对照,造急性中耳炎豚鼠模型。3天后基底膜切片及铺片若单明-鬼笔环肽(Phalloidin)染色,荧光显微镜(Olympus)及共聚焦显微镜观察。结果三种途径注入的DCs均可以在中耳炎豚鼠的中耳粘膜发现。在豚鼠内耳前庭阶、鼓阶内可以发现大量的免疫细胞渗入,同时可见DC位于内耳,数目很少,分布于基底膜、血管纹、螺旋神经节及壶腹嵴。三组动物对照耳仅皮下注射组有一例在耳蜗发现DCs渗入。器官切片除脑脊液组在脑中发现DC外,其余均未见DCs渗入。结论 DCs可以通过不同途径参与中耳炎所致的内耳免疫反应。作为最强的抗原提呈细胞,免疫反应的启动者,DCs在内耳诱导强烈的免疫反应,这种免疫反应可能对内耳的结构和功能产生不可逆的严重损伤,DCs功能紊乱可能为自身免疫性内耳疾病的原因之一。提示抑制过度免疫反应能够有效保护内耳的免疫损伤。     

大鼠嗅球神经干细胞培养

目的　建立大鼠嗅球神经干细胞 (neuralstemcells,NSC)体外培养方法 ,研究其增殖和分化特性。方法　采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养新生第 1天和成年大鼠嗅球NSC ,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSC及自然分化为特异性神经细胞的类型 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定嗅球NSC的生长曲线。结果　从生后第 1天和成年大鼠嗅球分离、培养出表达巢蛋白(nestin) ,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSC。生后第 1天和成年大鼠嗅球的神经球形成率分别为 2 0 %～ 30 %和 0 1%。嗅球NSC的增殖依赖表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor basic,bFGF) ,其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF。结论　从生后第 1天和成年大鼠嗅球可以培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSC。