寡脱氧核苷酸抑制N-ras癌基因表达及肝癌细胞增殖的实验研究

目的 了解三螺旋形成寡核苷酸（ＴＦＯ）、反义寡核苷酸（ＯＤＮａｓ）抑制肝癌细胞生长的作用。方法 以Ｎ－ｒａｓ第二转录起始位点及翻译起始区１－６密码为靶点，合成１２聚硫代磷酸ＴＦＯ（ＴＦＯ１２）、１９聚硫代磷酸ＯＤＮａｓ（ＯＤＮａｓ１９）、同时合成１９聚无关序列硫代磷酸寡核苷酸对照（ＯＤＮｃｏｎ）。在人肝癌Ｂｅｌ７４０２细胞观察了充代磷酸寡核苷酸对Ｎ－ｒａｓ表达ｐ２１蛋白的抑制及对细胞增殖的影响。结     

HCV体外复制细胞模型的建立

目的 建立HCV体外复制细胞模型。方法 用含有生长HCV基因的p90／HCVFL-longp U质粒，转化Sure细胞，36℃摇菌18h，提取质粒，以线性化DNA为模板，用T7RNA体外转录系统作体外转录，转录产物RNA作RT-PCR、普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用lipofectin包裹HCVRNA转染生长良好的HepG2细胞。转染48h后收集细胞，TRIzol提取RNA，分别用正链及负链引物作RT-PCR，确定转染细胞中有无HCV的复制中间体及病毒核酸。作免疫组化确定有无病毒NS3、NS5抗原。结果 体外可获得高浓度全长HCV-RNA，但转染未获成功。结论 全长HCV-RNA转染细胞模型的建立尚需进一步研究。     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139

目的：建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性.方法：选择EHEC O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uidA）;霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位（ctxA）、毒力协调菌毛A亚单位（tcpA）、糖基转移酶（glycosotransferase LPSgt）基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰.在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针.随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本.结果：PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏.结论：所研制的同时定性检测EHEC O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法.     

辐射相关基因芯片的制备及其在肺癌细胞中的应用

目的 寻找参与肺癌细胞辐射抗性的基因。方法构建辐射相关的基因芯片，初步筛选出在不同辐射敏感性肺癌细胞系中差异表达的基因。为了评价芯片结果的可靠性，我们对一些差异表达基因进行了RT-PCR验证。结果和辐射敏感的NCI-H446细胞相比，辐射抗性的A549中有18个基因有明显的改变，8个基因是上调，10个基因是下调。在照射后6h和24h，A549细胞中分别有22个基因(19个基因上调，3个下调)和26个基因(8个上调，18个下调)的差异表达；NCI-H446细胞中分别有17个基因(9个基因上调，8个下调)和18个基因(6个上调，12个下调)差异表达。从这些基因中，我们发现一些参与细胞增殖和抗凋亡的基因，在照射后的A549细胞中是增高的，而在NCI-H446细胞中是降低的。另外一些参与DNA修复的基因，在A549中比在NCI-H446细胞中有更高的表达。结论一些参与细胞DNA修复、细胞周期调控、细胞增殖和抗凋亡作用的基因可能有助于A549细胞辐射抗性的形成。     

反义寡核苷酸的化学修饰

反义寡核苷技术(antisense oligonucleotide technology.ASON)最初是指与单链RNA互补的一段寡核苷酸序列。随着研究的不断深入,发现寡核苷酸不仅可与单链RNA结合形成DNA-RNA杂合体,而且某些特殊序列还可与双链DNA结合形成三链核酸(triplex)。人们将前者称为反义(antisense),后者称为反基因(antigene)以示区别。此外,还将能够竞争蛋白结合单链或双链     

脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对HCV 5''-非编码区的抑制活性

目的　观察特异性脱氧核酶 (DRz)在丙型肝炎病毒 (HCV) 5′ 非编码区 (5′ NCR)转基因肝癌细胞株中对靶RNA的抑制活性。方法　采用 5′ GGCTAGCTACAACGA 3′基序为活性中心 ,分析HCV 5′ NCR中符合 5′…R↓Y… 3′(R =A/G ,Y =U/C)特征的位点及 5′ NCR的二级结构以确定靶位 ,设计并合成HCV靶向性脱氧核酶DRz 2 32、DRz 12 7、DRz 84、DRz1以及对应的两端被硫代修饰的DRz(TDRz)和活性中心区人工突变的硫代DRz(MDRz)。用脂质体转染法将导入HCV 5′ NCR及部分C区 (5′ NCR C)的转基因肝癌细胞株HepG2 .970 6 中 ,作用一定时间后 ,用化学发光法检测荧光素酶活性的变化 ,计算抑制率。选择抑制率较高者进行时效关系的观察和不同浓度抑制效果的比较。结果　各DRz和对应TDRz的活性无明显差别。DRz 12 7/TDRz 12 7和DRz1/TDRz1的抑制活性相对较高 ,终浓度为 0 .5 μmol/L作用 2 4h抑制率分别达 5 3.2 % / 5 0 .6 %和 4 4 .7% / 4 3.3%。各DRz/TDRz的抑制率均高于对应的MDRz ,其中DRz 12 7/TDRz 12 7与MDRz 12 7(4 1.2 % )相比抑制率有显著性差异 ,P <0 .0 5。在 0 .2 5～ 0 .75 μmol/L范围 ,抑制率随药物浓度的升高而增高。在所观察的时间点中 ,加药后 2 4h抑制率最高 ,3d后抑制率显著下降 ;DRz抑制率的下降快     

端粒酶逆转录酶小干扰RNA对肝癌细胞的体外抑制作用

目的 研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞SMMC-7721中抗肿瘤作用。方法 针对hTERT基因编码区及非编码区，采用T7转录系统在体外合成了2条siRNA，转染SMMC-7721细胞。以四甲基偶氮唑盐试验、逆转录聚合酶链反应及western blot观察其对SMMC-7721细胞增殖、hTERT mRNA及蛋白表达的影响。结果 2条siRNA以剂量依赖性方式抑制了SMMC-772l细胞增殖，当给药浓度为100nmol／L时，对hTERT mRNA及蛋白表达有明显的抑制作用。结论 靶向hTERT的siRNA对hTERT基因表达有抑制效果，有可能发展为一种新的抗肿瘤药物。     

乙醇代谢相关酶寡核苷酸基因芯片的制备及应用

20世纪 90年代 ,基因芯片技术在美国率先开展。我国基因芯片技术还处于刚起步阶段 ,本研究尝试制备寡核苷酸基因芯片检测单核苷酸多态性 (singlenucleotidepolymor phisms ,SNP) ,并初步应用于酒精性肝病的研究。一、材料与方法1.研究对象 :16 5例嗜酒者 ,其中无肝脏损害的 4 3例 ,酒精性肝病 12 2例 ,年龄 2 5～ 70岁 ,平均 4 4 .0岁。正常对照组 6 5例 ,年龄 2 6～ 6 8岁 ,平均 4 5 .9岁。所有研究对象均来自浙江省酒精性肝病流行病学调查人群。诊断标准参照“酒精性肝病的诊断依据及治愈、好转标准”[1] ,并排除乙型肝炎表面抗原和丙型…     

可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

乙型肝炎病毒细胞和动物模型研究进展

合适的细胞和动物模型不仅是研究病毒感染和致病机理的基础，同时也是筛选和评价抗病毒药物的前提。肝炎病毒，特别是乙型肝炎病毒是严重威胁人类健康的大敌。在研究ＨＢＶ药物和疫苗的过程中，已经建立了一些ＨＢＶ感染和转基因细胞及动物模型，并在ＨＢＶ感染机理和抗ＨＢＶ药物的研究中发挥了重要作用。