左归丸对激素性骨质疏松大鼠腰椎骨组织mTORC1 mRNA表达的影响

目的探讨左归丸防治激素性骨质疏松的可能作用机制。方法 18只SD大鼠随机分为空白组、模型组、左归丸组,每组6只。模型组、左归丸组皮下注射地塞米松磷酸钠注射液0.6 mg/kg,每3天注射1次,构建激素性骨质疏松大鼠模型。左归丸组在造模第1天开始给予左归丸溶液1.9 g/(kg·d)灌胃,空白组、模型组给予生理盐水灌胃1 ml/(100 g·d),连续8周。检测大鼠腰椎骨密度、生物力学指标及腰椎骨组织Runt相关转录因子2(Runx2)、组织蛋白酶K(CTSK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(m TORC1)mRNA表达,HE染色观察腰椎形态学改变,检测大鼠血清碱性磷酸酶(AKP)活性。结果HE染色显示,模型组骨小梁内骨细胞数量减少,骨小梁表面成骨细胞及破骨细胞稀疏;与模型组比较,左归丸组骨小梁内骨细胞数量、骨小梁表面成骨细胞及破骨细胞明显增多。与空白组比较,模型组大鼠骨密度、骨矿物质含量、压缩强度、能量吸收值、m TORC1 mRNA表达及血清AKP活性降低(P0.05);而左归丸组大鼠腰椎骨密度、骨矿物质含量、压缩强度、m TORC1 mRNA表达及血清AKP活性水平高于模型组(P0.05)。结论左归丸能有效改善激素性骨质疏松,m TORC1可能是其重要靶点。     

小鼠髓核细胞体外衰老模型的建立及评价

【摘要】 目的：建立并评价小鼠髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）体外衰老模型。方法：取8周龄C57BL/6雄性小鼠，体外分离培养小鼠NPCs，并采用细胞免疫荧光（immunofluorescence，IF）检测NPCs标志蛋白聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达进行细胞鉴定。取不同浓度（0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L）的叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide，TBHP）干预NPCs，采用CCK8法检测干预2h、4h后的细胞活性，筛选TBHP的最佳干预浓度及时间。应用最佳干预浓度TBHP、最佳干预时间干预P1代NPCs后换成完全培养基继续培养24h、48h、72h，采用衰老相关β半乳糖苷酶染色（senescence-associated β-galactosidase staining，SA-β-gal）检测各时间点的衰老NPCs阳性率，观察不同时间点NPCs的衰老变化。将P2代NPCs分为对照组和模型组，对照组在完全培养基中培养，模型组加入最佳干预浓度TBHP干预最佳时间干预后换成完全培养基培养，采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测两组细胞衰老相关基因p53、p21、p16以及Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ）、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5，ADAMTS-5）、基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）mRNA表达，免疫印迹法（Western blot，WB）检测Aggrecan、Collagen Ⅱ、MMP-3、MMP-13、p53、p21蛋白表达水平。结果：分离培养的细胞高表达Aggrecan，为NPCs。TBHP最佳干预浓度为100μmol/L，最佳干预时间为4h。在100μmol/L TBHP干预4h后培养24h、48h、72h，NPCs的SA-β-gal染色阳性率均显著性增加（P＜0.05），三个时间点间无统计学差异（P＞0.05），后续模型组加入最佳干预浓度TBHP干预最佳时间干预后换成完全培养基培养24h，对照组培养相同时间。RT-qPCR检测模型组p53、p21、p16、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5 mRNA表达较对照组显著性升高（P＜0.05），Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA表达较对照组显著性降低（P＜0.05）；WB检测模型组MMP-3、MMP-13、p53、p21蛋白表达较对照组显著性升高（P＜0.05），Aggrecan、Collagen Ⅱ蛋白表达较对照组显著性降低（P＜0.05）。结论：采用TBHP诱导能成功构建小鼠NPCs体外衰老模型，可为椎间盘退行性变的发病机制研究提供良好的研究样本。     

从少火生气理论探讨肾气丸促巨噬细胞M2型极化影响成骨的作用

目的 基于少火生气理论探讨肾气丸原组方（SQW）和肾气丸去除桂枝、附子（SQQ）诱导巨噬细胞M2型极化对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）成骨分化作用的效果差异。方法 采用CCK8法分别检测SQW、SQQ对RAW264.7细胞存活率的影响，以确定药物干预的安全作用浓度。将RAW264.7细胞分为CON组、IL-4组、IL-4+SQW组、IL-4+SQQ组。将不同药物组诱导巨噬细胞M2型极化后分泌的细胞上清液作为条件培养基培养BMSC，评估BMSC成骨分化的能力。用碱性磷酸酶染色法（ALP）及茜素红染色法（ARS）检测各组BMSC成骨分化能力；使用免疫荧光技术（IF）检测BMSC成骨标志蛋白骨形态发生蛋白4（BMP4）、骨保护素（OPG）的分布和表达；使用蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测M2型巨噬细胞极化相关的精氨酸酶1（ARG1）、白细胞介素10（IL-10）的表达以及BMSC成骨相关的BMP4、RUNT相关转录因子2（RUNX2）的表达。结果 与IL-4+SQQ组相比，IL-4+SQW组更加显著促进M2型巨噬细胞极化相关因子ARG1、IL-10上调（P＜0.01），且其条件培养基培养的BMSC的ALP及ARS染色增强，成骨蛋白BMP4、OPG、RUNX2表达升高（P＜0.05）。结论 肾气丸原组方与肾气丸去除桂枝、附子两味药相比，具备更强的促进巨噬细胞M2型极化与增强BMSC成骨分化能力，为少火生气理论提供了实验依据。     

龟板通过抑制炎症反应改善小鼠软骨终板退变

目的 探究龟板是否能够通过抑制炎症反应改善自然衰老小鼠的软骨终板退变。方法 以3月龄小鼠作为年轻对照组，采用自然衰老模型，选取24月龄的小鼠12只，随机分为老年组与龟板组，每组6只。采用苏木素伊红染色及番红O-固绿染色实验明确自然衰老小鼠是否发生软骨终板退变；免疫组化检测IL-1β在各组小鼠软骨终板组织中的表达情况；免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白在各组小鼠软骨终板组织中的表达情况。结果 与年轻对照组相比，老年组小鼠的HE染色表明其出现较为严重的软骨终板组织退变；与老年组相比，龟板组有一定程度的改善。番红O-固绿染色实验表明，与年轻对照组相比，老年组小鼠的软骨终板组织含水量减少；与老年组相比，龟板组小鼠的软骨终板组织胶原含量及含水量增加。组织免疫组化结果表明，老年组小鼠的软骨终板组织中IL-1β表达增加，药物干预后，龟板组小鼠的软骨终板组织中IL-1β表达减少。组织免疫荧光表明，与年轻对照组相比，老年组出现了明显的Ⅱ型胶原蛋白降解；药物干预后，龟板组有效地减少了Ⅱ型胶原蛋白的降解。结论 龟板可以通过抑制IL-1β减轻炎症，减少Ⅱ型胶原蛋白降解，从而改善自然衰老小鼠的软骨终板退变。     

扶阳法治疗盗汗探讨

历版教材均将盗汗归于阴虚证,笔者通过查阅大量文献,探讨清代名医郑钦安的扶阳思想,结合盗汗的渊源及治疗现状,就扶阳法治疗盗汗作一探讨,冀同道斧正。1中医对盗汗的认识吴鞠通曰:"汗也者,合阳气阴精蒸化而出者也。