创伤后巨噬细胞对T淋巴细胞的直接接触免疫抑制作用

本实验研究了创伤小鼠巨噬细胞对Ｔ淋巴细胞的直接接触抑制作用。结果显示：创伤后巨噬细胞可通过直接的细胞接触方式抑制正常小鼠Ｔ淋巴细胞转化、ＩＬ－２的产生、ＩＬ－２４的表达以及ＩＬ－２介导的淋巴细胞增殖，但对ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒ反应及ＩＬ－１的产生无明显影响，可明显提高Ｔｓ细胞抑制活性。去除正常小鼠淋巴细胞中的Ｔｓ细胞，可阻断创伤后巨噬细胞的这一抑制活性。提示：（１）创伤后巨噬细胞可通过ＩＬ－１以外的     

核因子-κB p50亚基同源结构域相互作用多肽的筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选获得与NF-kB p50亚基同源结构域(RHD)相互作用的多肽。方法应用酵母双杂交技术,以NF-kB p50 RHD为诱饵,筛选16肽cDNA文库,寻找与其相互作用的多肽,应用β-GAL实验、酵母交配实验及一对一酵母回复性杂交等方法筛除假阳性克隆,确定阳性克隆。结果经酵母双杂交及反复的排查,共获得8个阳性克隆。通过GenBank进行搜寻,未发现与之相匹配的蛋白序列。结论获得8个与NF-kB p50 RHD相互作用的新型多肽cDNA,多肽的功能需进一步验证。     

NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用多肽的筛选及功能鉴定

目的以NF-κB p65亚基DNA结合域为诱饵蛋白,筛选能够与其发生相互作用的多肽,并鉴定这些多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。方法首先利用PCR搭桥扩增方法获取NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,后将其克隆到酵母双杂交pGBKT7DNA-BD载体上,与GAL4DNA-BD融合,形成GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白;再以GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白为诱饵蛋白行酵母双杂交实验,自16肽随机肽库中筛选与NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用的多肽;最后选择性人工合成筛选获得的多肽,并进行EMSA实验检测相互作用多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。结果扩增获得了NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,并成功构建pGBKT7DNA-BD/p65BD载体。自1.28×107个酵母转化子中最终筛选获得5个阳性克隆,测序结果和同源氨基酸序列比对表明5个阳性多肽为p65BD新型相互作用多肽,其中4条多肽拥有一个共同的基序。EMSA实验结果表明合成的两条多肽对NF-κB的DNA结合活性均具有一定的抑制效应。结论经初筛、复选和假阳性鉴定,自16肽库中获得5个能与NF-κB p65亚基发生相互作用的新型多肽,并已证实其中两条多肽对NF-κB的DNA结合活性具有抑制效应。     

黄芪多糖及人参茎叶皂甙对创伤小鼠免疫器官影响

研究了黄芪多糖（ＡＳＰ）、人参茎叶皂甙（ＧＳＬ）对创伤小鼠免疫器官重量、细胞数目及形成结构的影响。结果表明：ＡＳＰ、ＧＳＬ对创伤小鼠脾脏、胸腺重量的减轻及其细胞数目的减少均具有明显的拮抗作用；对创伤小鼠脾脏、胸腺、肠系膜淋巴结病理形态学改变及淋巴细胞的变性与坏死具有一定的改善作用。     

黄芪多糖、人参茎叶皂甙对创伤小鼠血浆及免疫细胞内cAMP、cGMP的影响

本实验利用小鼠闭合性创伤模型，观察创伤后第４天小鼠血浆、免疫细胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ含量的变化及黄芪多糖（ＡＰＳ）、人参茎叶皂甙（ＧＳ）的调节作用。结果显示：创伤后小鼠血浆内ｃＡＭＰ水平增高，ｃＧＭＰ水平下降，ＣＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值升高。腹腔巨噬细胞及脾细胞、胸腺细胞、肠系膜淋巴结细胞在静息状态和激活状态时的ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ含量也显示相似的改变。ＡＰＳ（２５０ｍｇ／ｋｇ）、ＧＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）体内应用（每天一次，连续４天）可明显降低创伤小鼠血浆及免疫细胞内ｃＡＭＰ水平，升高其ｃＧＭＰ水平。一定浓度范围内的ＡＰＳ（５０～２５０μｇ／ｍｌ）、ＧＳ（１．０～１００μｇ／ｍｌ）在体外可明显拮抗创伤小鼠激活状态的巨噬细胞及脾细胞内ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值的增高。提示：ＡＰＳ，ＧＳ可纠正创伤小鼠血浆及免疫细胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ的比例失衡。     

创伤小鼠淋巴细胞膜脂流动性的变化

本文检测了小鼠闭合伤、截肢伤及烧伤后淋巴细胞膜脂流动性的变化。结果显示，创伤后来源于脾脏、胸腺及肠系膜淋巴结的淋巴细胞膜荧光偏振度、膜脂区微粘度及分子排列有序性系数均增加，表明淋巴细胞膜脂流动性降低，以伤后２￣１０天最为明显。创伤后脾细胞经Ｔ细胞丝裂原ＣｏｎＡ、ＰＨＡ刺激２４ｈ或４８ｈ，其细胞膜脂流动性明显低于正常，而经Ｂ细胞丝裂原ＬＰＳ作用后，其细胞膜脂流动性同正常无明显差异。上述结果表明，创伤     

活性氧与细胞核共染影响因素的实验研究

目的 利用二氯荧光黄二乙酸酯(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)探针和4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(4',6'-diamidino-2-phenylindole,DAPI)探讨影响活性氧(reactive oxidative species,ROS)和细胞核共染的因素,以优化最佳的研究方案.方法 以RAW 264.7细胞株为研究对象,首先采用不同浓度的多聚甲醛分别固定10、30 min,1、2、4h,进行ROS和DAPI检测;再用不同的固定试剂分别在ROS检测前和后固定,检测ROS荧光强弱;将DAPI在DCFH-DA探针加入前12、4、2、1h,20 min加入和两者同时加入,检测DAPI染色情况;最后,DAPI在ROS检测前12 h加入,以不加DAPI组为对照,分别用LPS和H2O2刺激产生ROS并检测,计算其荧光数和平均荧光强度,利用SPSS18.0软件进行t检验分析.结果 不同固定浓度、固定试剂、固定顺序的结果均表明,固定虽然会增强DAPI的染色,但同时会减弱ROS的荧光强度;活细胞DAPI染色时,随着染色时间的延长,核着色强度和均匀度都更好;DAPI染色12 h后检测ROS,对ROS的荧光数和平均荧光强度都没有统计学影响(P＞0.05).结论 DCFH-DA探针法检测ROS荧光时不能与细胞固定连用;DAPI在DCFH-DA探针孵育前12h加入,并不影响ROS荧光的产生和检测,该研究方案可有效实现ROS与DAPI的共染.     

吴茱萸碱对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用

目的 探究吴茱萸碱(evodiamine,EVO)对酵母多糖(zymosan)诱导的急性肺损伤的保护效应及其作用机制.方法 24只6～8周龄雄性C57BL/6小鼠,按随机数字表法分为正常对照组、EVO对照组、模型组、EVO治疗组,每组6只.各组分别于处理作用12 h后处死小鼠,收集眼眶血及肺组织.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血液及肺组织中白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-0(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平及肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及核转录因子NF-κBp65的DNA结合活性,TUNEL法检测肺组织细胞凋亡情况,HE染色观察肺组织病理改变并测量肺湿干质量比.结果 酵母多糖作用12h后,小鼠出现精神萎靡、活动减少等症状.EVO治疗组小鼠状态有所好转.EVO可明显改善酵母多糖所致的肺泡壁毛细血管扩张充血及炎性细胞浸润,降低肺湿干质量比,并显著下调酵母多糖刺激下血清和肺脏中IL-6和TNF-α的含量(P＜0.01),同时抑制肺组织中MPO含量以及NF-κB p65的DNA结合活性(P＜0.01).结论 EVO可缓解酵母多糖诱导的急性肺损伤.该作用可能是通过抑制NF-κB的活性以减少炎症介质释放实现.     

黄芪多糖、人参茎叶皂甙对创伤小鼠淋巴细胞膜流动性及脂质过氧化作用的影响

从伤后0～3天,每天一次给以黄芪多糖(250mg/kg,ip)和人参茎叶皂甙(50mg/kg,sc)可明显提高创伤小鼠脾脏、胸腺、肠系膜淋巴结细胞质膜、线粒体膜及微粒体膜的流动性,降低创伤小鼠血清及淋巴细胞中过氧似旨质水平,并增加超氧化物岐化酶的活性。     

人参茎叶皂甙对创伤小鼠活化T细胞内CAMP代谢、蛋白激酶A活性的影响

皮下注射人参茎叶皂甙(GS)50mg／kg，连续4天。可明显拮抗撞击创伤小鼠活化T细胞内CAMP含量、腺苷酸环化酶(AC)、蛋白激酶A(PKA)活性的升高及CAMP-磷酸二酯酶(CAMP-PDE)活性的降低。0．1～100p．g／ml的GS在体外也可降低创伤小鼠活化T细胞内CAMP含量及AC和PKA的活性，并升高CAMP-PDE活性。表明GS对创伤后T细胞功能受抑状态的纠正作用与此有关。