人骨髓间质干细胞体外培养及诱导成骨的鉴定

目的 优化人骨髓间质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)体外分离培养方法,对hBMSCs体外培养及诱导成骨能力进行鉴定.方法 密度梯度离心法分离hBMSCs,流式细胞分析法(FACS)对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测.以含地塞米松(1×10-7 mmol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、抗坏血酸(35.22 mg/L)的DMEM培养液对hBMSCs进行诱导分化,相差显微镜和透视电镜观察细胞形态,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶染色(ALP),免疫组化检测Ⅰ型胶原,茜素红法进行钙结节染色.结果 hBMSCs可在体外分离扩增,表达CD44、CD105和CD106,不表达CD34和CD45,细胞活力为92.3%,G0-G1细胞占94.2%.经成骨培养液诱导后细胞形态由长梭形向多边形转变,ALP染色、Ⅰ型胶原染色及钙结节染色均为强阳性.结论 hBMSCs可在体外长期、稳定培养,具有向成骨细胞分化的潜能.     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损（英文）

背景：以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况。目的：观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性。方法：将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料。术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色。结果与结论：实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组（P〈0.05）。说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法。     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

背景:以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况.目的:观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性.方法:将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种...     

应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化

目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞。方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、表皮生长因子20μg/L、100U/mL青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养。3～5d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞。取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液。②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5d。常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞。对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液。③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率。RT-PCR检测标志性基因的表达。结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24h内聚集成细胞球并悬浮生长。免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多。第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性。当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性。RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达。另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin。②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%。结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞。     

纤维蛋白原活性在冠心病发展中的作用

目的:探讨纤维蛋白原活性升高在冠心病发展中的可能作用。方法:用血液流变学方法检测冠心病患者稳定期和心绞痛患者的纤维蛋白原活性。结果:冠心病患者血浆纤维蛋白原水平及其血浆粘性显著高于正常对照组(P＜0.01,P＜0.05),并且心绞痛患者纤维蛋白原活性和血小板聚集性(Pt max、Pt H、Pt K)也同时高于正常对照组(P＜0.01),并发现心绞痛组纤维蛋白原活性值与Pt max、PtH呈显著负相关(r＝-0.8379,P＜0.01;r=-0.8784,P＜0.01)。结论:纤维蛋白原活性升高在冠心病发展中起一定作用。     

PLGA复合Ⅱ型胶原和生长因子诱导组织 工程软骨修复兔关节软骨缺损

 【目的】 观察骨髓基质干细胞(BMSCs)种植到复合胶原和生长因子的聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)生物材料上,再种植到兔体内,进一步诱导成组织工程软骨组织的可行性,并观察此组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的能力｡【方法】 相分离法制作PLGA,复合Ⅱ型胶原和成软骨生长因子bFGF,TGF-β1｡将P3代的BMSCs种植到复合材料上｡36只新西兰大白兔随机分为实验组､对照组､空白组,分别于肌袋内植入BMSCs/复合生长因子和胶原的PLGA､复合生长因子和胶原的PLGA､复合胶原的PLGA,于术后第4､8､12周取材观察细胞的定向分化及生长情况,包括大体观察､苏木精-伊红染色､甲苯胺蓝染色､Ⅱ型胶原染色､扫描电镜观察｡16只新西兰白兔分2组,上述组织工程骨植入实验兔膝关节软骨缺损处,对照组仅做缺损,12周后取材初步观察修复情况｡【结果】 大体观察可见实验组材料有类软骨样组织生长,而对照组和空白组则仅见纤维组织生长｡各种染色及电镜观察显示:实验组复合物内可见多的成软骨细胞及少量的破骨细胞｡实验组甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色为阳性,对照组和空白组均为阴性｡大体观察兔膝关节软骨缺损得到修复,苏木精-伊红染色显示表面关节软骨形成,与周围正常软骨形成连接｡【结论】 胶原修饰的PLGA生物材料具有较好的细胞相容性;BMSCs种植到复合胶原和生长因子的PLGA生物材料上在兔体内可诱导成为组织工程软骨复合组织,并初步证实有修复兔关节软骨缺损的能力｡     

C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系的建株(英)

 目的：建立C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系。 方法： 收集3.5 d.p.c.的囊胚，培养在预先铺有小鼠成纤维细胞（MEFs）的高糖DMEM培养液中。3-4 d后，挑出内细胞团（ICM），消化后重新种到新鲜的有MEFS培养液中。等到有典型的ES样集落长出，即传代以得到永久ES细胞系。通过分析碱性磷酸酶活性，SSEA-1，Oct-4的表达和形成畸胎瘤的能力来鉴定ES细胞的多向分化能力。 结果： 获得的两个C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系绝大多数细胞具有正常的核型（40，XY），碱性磷酸酶染色阳性，SSEA-1，Oct-4表达阳性， ES细胞注入SCID鼠后可获得来自3个胚层的组织。 结论： 建立了两株具有长期自我更新能力和多向分化潜能的C57BL/6J×129/J杂交小鼠ES细胞系。     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

背景:以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况.目的:观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性.方法:将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料.术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色.结果与结论:实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组(P < 0.05).说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法.     

阿仑膦酸钠对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究

目的探讨阿仑膦酸钠(ALN)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和骨向分化能力的影响,观察其促BMSCs骨向分化过程中对转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响,分析可能的作用途径。方法以碱性磷酸酶(ALP)等指标确定干预药物不同浓度梯度中最佳促BMSCs骨向分化剂量;分组实验,通过检测诱导分化过程中ALP和钙化结节等指标的表达,观察其对BMSCs骨向分化能力的影响;ELISA法检测骨向分化过程中TGF-β1、BMP-2的表达。结果 ALN最佳促BMSCs增殖和骨向分化浓度为1×10-8mol/L,该浓度ALN能促进成骨指标的表达和TGF-β1和BMP-2分泌增加;具有促BMSCs骨向分化能力的ALN各诱导组均伴随TGF-β1和BMP-2分泌增加。结论 ALN能促进BMSCs增殖和骨向分化;在BMSCs骨向分化过程中,上调TGF-β1、BMP-2的表达量可能是各干预药物促进MSCs骨向分化的作用机制之一。     

从脊柱内镜手术摘除组织中分离髓核间充质干细胞及其生物学特征鉴定

目的:利用经皮内镜下腰椎间盘切除术获取来源明确的髓核组织,结合组织块培养法高效分离培养人髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells,hNP-MSCs),并鉴定其生物学特征。方法:收集6例腰间盘突出症手术摘除的髓核组织,利用组织块培养法分离培养。取第3~6代生长良好的细胞用于实验,采用CCK-8检测增殖能力;用流式细胞术检测细胞表面标志物;并分别向成骨、成脂和成软骨方向诱导分化,用油红O染色、茜素红染色及阿利新蓝染色对分化结果进行检测。结果:成功从椎间盘内镜摘除的髓核组织中分离培养具有增殖能力的细胞,流式细胞术检测显示细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD73和CD105等间充质干细胞抗原,不表达造血干细胞标志CD34和CD45。生长曲线显示符合正常间充质干细胞增殖特征。茜素红染色、阿利新蓝染色及油红O染色均呈阳性,说明分离培养的细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪诱导分化的能力。结论:首次结合椎间盘内镜微创手术和组织块培养法,体外高效分离培养了具有自我更新能力和多向分化潜能的hNP-MSCs。