抗人有机阴离子转运蛋白4多克隆抗体的制备及其在肾脏的定位研究

目的:拟采用一套新的基因免疫系统制备高特异性和高效价的小鼠抗有机阴离子转运蛋白4(hOAT4)多克隆抗体,并用该抗体对hOAT4在人肾小管上皮细胞的表达进行定位研究.方法:应用Accelrys软件分析hOAT4抗原表位,选择其中免疫源性较强的细胞内表位(E278～R345),从人肾组织总RNA中用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增其204 bp的cDNA序列,克隆到pBQAP-OVA构建基因免疫载体,鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-FlT3L同时免疫小鼠,5周后取血清抗体,ELISA方法测定抗体滴度,人肾组织Western blot和免疫组化鉴定抗体的特异性和定位表达.结果:成功构建基因免疫载体pBQAP-OVA-hOAT4,经酶切及序列分析鉴定完全正确.ELISA方法测得抗体滴度高达1∶3 000,该抗体识别人肾皮质膜蛋白和肾小管刷状缘蛋白65 kD糖基化的hOAT4.人肾组织免疫组化结果提示该抗体识别定位在近段肾小管上皮细胞刷状缘的hOAT4.结论:用基因免疫方法可以成功制备高效价和高特异性抗hOAT4多克隆抗体.     

大鼠肾组织PAM染色法改良

1．1 大鼠肾组织石蜡切片Wistar大鼠肾组织石蜡块6块，每块切片2张，分别采用常规PAM(periodic acid-silver methenamine)染色和改良法染色。     

急慢性马兜铃酸肾病的临床病理特点及其病理机制

目的分析急、慢性马兜铃酸肾病的临床与病理学特点,探讨其慢性化的病理学机制。方法回顾性分析26例明确诊断为马兜铃酸肾病患者的临床与病理资料,依照病理特点分为急、慢性组,应用免疫组织化学方法观察患者肾活检组织标本中III型胶原、I型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI1)、基质金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果26例马兜铃酸肾病患者,急性组11例,慢性组15例(其中女性12例,男性3例)。慢性组用药时间[(142.3±52.7)个月]明显长于急性组[(4.5±2.7)个月],在临床指标上合并高血压的比例高、收缩压水平高[慢性组平均收缩压(156.7±32.4)mmHg(1mmHg=0.133kPa),急性组平均收缩压(127.3±24.2)mmHg]贫血重、尿蛋白少(P值均<0.05);在病理改变上球性硬化、间质纤维化、肾小管萎缩、血管损伤的程度重(P值均<0.05);间质、肾小管上皮细胞III型胶原、PAI1、TIMP1表达明显增强(P值均<0.05)。结论急、慢性组马兜铃酸肾病患者临床与病理特点不同;PAI1、TIMP1在其慢性化进展中可能起重要作用。     

增龄对急性肺损伤大鼠肺组织ICAM-1和MCP-1表达的影响

目的研究增龄对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺组织MCP-1和ICAM-1表达的影响,探讨老年大鼠对炎性刺激易感的可能机制。方法青年及老年大鼠均随机分为对照组和LPS组。应用免疫组化技术检测大鼠肺组织ED-1阳性细胞浸润情况,应用Western blot和Northern blot分别检测肺组织MCP-1和ICAM-1蛋白质和基因表达。结果(1)青年和老年对照组大鼠肺组织内几乎无ED-1阳性细胞,注射LPS后,青年和老年LPS组ED-1阳性细胞浸润均明显增强,并且老年鼠明显多于青年鼠(P<0.05)。(2)青年和老年对照组大鼠肺组织内均有基础量的MCP-1和ICAM-1表达,老年与青年组之间有显著性差异,注射LPS后青年和老年大鼠MCP-1和ICAM-1表达均较对照组显著上调,老年大鼠上调更加明显,具有显著性差异(P<0.05)。以相同鼠龄MCP-1和ICAM-1表达的增加量为变量,进行t检验,发现老年MCP-1和ICAM-1表达的增加量仍显著高于青年大鼠(P<0.05)。结论增龄可上调肺组织MCP-1、ICAM-1表达,并加强脂多糖诱导MCP-1、ICAM-1表达的作用,加重肺部炎症反应。     

衰老大鼠肾小管间质细胞表型转化及意义

目的通过检测肾小管间质细胞表型转化的标志物,明确其在肾脏衰老过程中的意义.方法选用3月、12月与24月Wistar大鼠,采用免疫组化方法检测肾小管间质中细胞表型标志α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),细胞增殖标志.增殖性细胞核抗原(PCNA)与细胞外基质[Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白(FN)]在不同月龄大鼠肾小管间质中的表达.采用真彩医学图像分析系统进行定量分析.结果肾小管间质随增龄出现明显的病理变化.24月龄大鼠肾间质中α-SMA表达明显增多,而在3月龄除血管平滑肌外未见间质中阳性表达.PCNA在12月龄表达最为明显,与3月龄与24月龄存在显著性差异(P＜0.05).肾小管间质中细胞外基质Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及FN随着增龄表达明显增加,24月龄与3月龄及12月龄相比存在显著性差异(均P＜0.05).Ⅰ型胶原、FN与间质纤维化程度呈正相关(r=0.63与r=0.78,均P＜0.01).结论衰老大鼠肾小管间质细胞表型发生明显变化,这种细胞表型的转化可能参与了肾脏的衰老结构的改变与功能的减退.     

IgA肾病患者血管内皮细胞生长因子及其受体的表达

肾小球内皮细胞是肾小球血管壁的重要组成部分 ,对于维护肾小球血管壁的完整性具有重要的意义。血管内皮细胞生长因子 (VEGF)能促进内皮细胞的增生、迁移 ,增强内皮细胞通透性。本研究通过观察IgA肾病患者肾组织内VEGF及其受体 (flk 1 )和Ⅳ型胶原的表达 ,分析VEGF、flk 1表达与IgA肾病患者尿蛋白、血压、血肌酐、肾小球Ⅳ型胶原表达的关系。一、对象与方法1 .对象 :IgA肾病患者 2 4例 ,男 1 4例 ,女 1 0例 ,年龄1 6～ 49岁 ,平均 (2 8 6± 1 1 7)岁。所有患者均行肾活检术 ,肾组织病理检查符合IgA肾病诊断。根据病理改变的程度分…     

慢性移植物抗宿主病狼疮小鼠模型肾组织细胞凋亡及Th1/Th2细胞因子的研究

目的研究慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样小鼠模型。肾组织细胞凋亡及Th1／Th2细胞因子的改变方法20只B6D2F1代杂交鼠，随机分为模型组(10只)及对照组(10只)，12周后处死采用原位末端标记法(TUNEL)染包观察肾组织细胞凋亡；免疫组织化学、Western blot和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测Fas、FasL基因转录及蛋白表达情况。结果TUNEL法结果显示模型组肾组织细胞凋亡较对照组增多。免疫组织化学提示：各组均有Fas、FasL表达，正常对照组有极少量Fas表达．表达部位在肾小球系膜细胞；FasL表达部位在近端肾小管上皮细胞。聚合酶链反应(PCR)结果：模型组较正常对照组Fas mRNA表达增高。模型组较正常对照组FasL mRNA表达差异无显著性。正常对照组干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-4阳性细胞极少；模型组肾组织血管周围浸润的炎性细胞中可见IFN-γ和IL-4阳性细胞，且IL-4阳性细胞明显高于IFN-γ，提示Th2细胞表达占优势。模型组比正常对照绀INFγ／和IL-4阳性细胞明显升高，RT-PCR结果显示：模型组IFN-γ与正常对照组比较差异无显著性：模型组IL-γ较正常对照组显著升高。结论cGVHD狼疮样小鼠模样小鼠模织细胞凋亡异常及Th1/Th2细胞因子失衡，在狼疮肾炎(LN)的发病中起重要作用。     

人TIMP-1转基因小鼠肾组织内外源基因功能表型的鉴定

目的 对人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）转基因小鼠肾组织内外源人TIMP-1基因的功能表型进行鉴定,为深入研究TIMP-1在肾脏疾病进展过程中的病理生理作用奠定基础。方法 3月龄野生型小鼠（n=8,正常组）和hTIMP-1转基因小鼠（n=8）肾组织石蜡切片行PAS染色,观察肾脏组织结构变化。采用Northern杂交、Western印迹方法检测两组小鼠肾组织内h／mTIMP-1、mTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、MMP-9、MMP-2和COLⅣa5mRNA及蛋白质表达;明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的活性。反向酶谱法检测TIMP-1的活性。结果 hTIMP-1转基因小鼠与正常组小鼠相比,肾组织结构未见显著变化。与正常组小鼠相比,hTIMP-1转基因小鼠肾组织内h／mTIMP-1mRNA、蛋白表达及活性显著升高（P＜0．05）;TIMP-2、MMP-2mRNA和蛋白表达降低（P＜0．05）;MMP-9的活性增高（P〈0．05）,而MMP-2的活性则降低（P＜0．05）。两组小鼠mTIMP-1、TIMP-3、MMP-9和COLIVa5的mRNA表达没有显著性差异（P＞0．05）。结论 外源基因在人TIMP-1转基因小鼠肾组织内稳定表达并导致MMPs／TIMPs系统发生代偿性变化。     

金属蛋白酶组织抑制剂1在大鼠肾小管间质损害中的表达及其意义

目的 观察单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型中金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)在肾小管间质中的表达部位、动态变化及其与肾小管问质损害的关系。方法 制备UUO大鼠模型,采用免疫组织化学方法检测UUO术后第1、3、5、7、14天肾小管间质中TIMP-1、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、增殖细胞核抗原(PCNA)和单核巨噬细胞抗原(ED)-1的表达及其与输尿管梗阻后肾小管间质损害的关系。结果 UUO术后第1天肾间质可见少量TIMP-1表达细胞,第3～7天TIMP-1表达明显增加,主要表达于肾小管上皮细胞和肾间质。UUO术后第3天肾小管PCNA表达达高峰,随后下降,而肾间质PCNA水平于第7～14天仍较高。UUO术后第3天肾间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞可检出α-SMA表达并随时间递增。α-SMA阳性面积与肾间质相对面积成正相关(r=0.924,p<0.01)。TIMP-1表达与间质相对面积(r=0.835,P<0.05)及α-SMA阳性面积(r=0.922,P<0.01)成正相关。结论 TIMP-1蛋白质于肾小管间质病变早期表达于肾小管间质,早于肾间质纤维化出现,其表达量与肾间质α-SMA表达及肾间质相对面积呈正相关并随病变进展逐渐增加。TIMP-1在肾小管上皮细胞和问质细胞的高表达及肾小管上皮细胞和间质细胞增殖可能参与介导UUO术后肾小管间质损害。     

实验性视网膜脱离及复位后视网膜色素上皮细胞抗增殖性细胞核抗原的表达

目的 观察视网膜脱离和复位过程中抗增殖性细胞核抗原(proiferating cell nuclear antigen, PCNA)表达的状况，以评价其在接触抑制机制中的意义。 方法 对72只猫眼行晶状体 囊外摘除和玻璃体切除手术。3周后，利用微穿刺技术制作视网膜脱离和复位动物模型，在不同时间取眼球并制成组织切片。采用免疫组织化学方法，观察视网膜脱离后视网膜色素上皮(retinal pigment-epithelium, RPE)细胞PCNA的表达。光镜下确定PCNA阳性的RPE细胞并量化增殖反应。采用方差分析(ANOVA)方法 ，对脱离组的脱离区和非脱离区及复位组复位区RPE细胞层PCNA的表达水平进行比较。 结果 在视网膜脱离后24 h，脱离组脱离区视网膜RPE细胞层出现PCNA阳性细胞 ，5～6 d达到高峰，20 d后逐渐回落。在复位组复位区，PCNA标记的RPE细胞明显少于脱离组脱离区。脱离组非脱离区视网膜很少有PCNA标记的RPE细胞。3组PCNA标记的RPE细胞数比较，差异有显著性的意义。 结论 视网膜脱离诱导RPE细胞增殖，而视网膜复位后这种增殖受到抑制。表明视网膜复位过程中，接触抑制的机制在发挥作用。（中华眼底病杂志，2003，19：20-23）