MDR1 RNAi表达克隆的质粒构建

目的:构建针对多药耐药基因(MDR1)的RNA干扰(RNAi)表达克隆质粒。方法:采用Invitrogen公司的Block-i TTMU6RNAi Entry Vector Kit和BLOCK-i T Lentiviral RNAi Expres-sion System生产表达克隆质粒。针对MDR1人工设计合成一段寡核苷酸,依照试剂盒说明书分别构建MDR1entryclone质粒和表达克隆质粒。以MDR1entry clone质粒瞬时转染MCF-7/ADM细胞株,MTT法测细胞对ADM的耐药性及流式细胞仪测试P-gp表达情况。抗生素筛选表达克隆、抽提质粒电泳鉴定。结果:测序证实MDR1entry clone质粒构建正确,无任何突变.转对照质粒组和转MDR1entry clone质粒组,P-gp表达水平分别为(31.97±1.2)%和(7.88±0.5)%,IC50分别为1.27和0.4μg/mL。两组比较,P-gp表达和IC50差异均有统计学意义,P均<0.05。抗生素筛选显示转化克隆对氯霉素敏感、对氨苄青霉素具抗性,抽提质粒琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒大小符合设计要求。结论:MDR1entry clone质粒和表达克隆质粒构建正确,为进一步阻断MDR1基因表达逆转肿瘤多药耐药奠定了基础。