Fc融合蛋白在药学领域的研究进展

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对Fc融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。     

lncRNA在免疫细胞及自身免疫性疾病中的研究进展

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是继miRNA后又一类具有调控功能的非编码RNA,其可在基因水平、转录水平和蛋白质水平等多方面影响疾病的发生发展。目前已在基因印迹、肿瘤疾病、神经退行性疾病等领域取得较好的研究进展,而其在自身免疫方面的研究才刚刚起步,但诸多lncRNA已被证实参与免疫细胞的发育分化,并在免疫系统稳态维持及自身免疫性疾病的发生发展中发挥重要作用。本文将从免疫细胞和自身免疫性疾病方面阐述lncRNA的研究进展。     

SUMO表达系统高效、可溶性表达重组鼠源IL-1β

目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础。方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO ex-press中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白。用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37kD,切割后的成熟蛋白为17kD,与理论值相符。且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在。Western blot证实该蛋白为mIL-1β。成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性。结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白。     

灵芝多糖GLPL1免疫原优化及其单克隆抗体制备

目的:优化灵芝多糖GLPL1免疫原,用于制备GLPL1单克隆抗体,为GLPL1免疫分析法建立提供物质基础。方法:GLPL1经1-氰基-4-二甲胺吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化后与牛血清白蛋白(BSA)共价偶联,制备系列拟糖蛋白GLPL1-BSA并考察其免疫原性;选择其免疫性强者免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备GLPL1特异性单抗。结果:共获得取代度(GLPL1/BSA摩尔比)分别为≈1、≈3、≈6三种拟糖蛋白GLPL1-BSA,其免疫小鼠后诱导产生强烈的抗GLPL1的IgM初次应答和IgG回忆应答,且GLPL1诱导小鼠主要分泌IgG2a独特型抗体;经细胞融合、筛选和亚克隆,获得一株分泌GLPL1特异性抗体杂交瘤细胞6G7,其抗体独特型为IgM。结论:成功优化、制备了灵芝多糖GLPL1的免疫用抗原和GLPL1特异性单克隆抗体。     

丹参酮ⅡA滴丸制备工艺的研究

研究新药丹参酮ⅡA滴丸的制备工艺,确立最佳工艺条件.设计正交实验考察滴丸制备工艺中各影响因素.以聚乙二醇4 000为基质,二甲基硅油为冷凝液,滴制工艺为滴制温度80℃,冷凝液5～25 ℃梯度冷却,滴距4 cm,滴速60滴/min.该工艺制得的滴丸成型性好,丸种差异小,崩解时限为17 min,符合药典规定.该工艺适合丹参酮ⅡA滴丸的制备,且适宜工业化生产.     

不同来源木瓜蛋白酶合成Aspartame前体能力的研究

研究了Ｓｉｇｍａ公司、Ｍｅｒｃｋ公司和广州远天酶制剂厂生产的木瓜蛋白酶和从木瓜青果中提取的木瓜蛋白酶在水－乙酸乙酯两相反应系统中合成二肽甜味剂Ａｓｐｅｒｔａｍｅ前体（Ｐ－ＡＰＭ）的能力,并以ＨＰＬＣ（流动相为乙腈－水＝４５：５５,检测波长２６０ｎｍ,流速１ｍｌ／ｍｉｎ）和ＴＬＣ（硅胶ＧＦ＿（２５４）板,展开剂为正丁醇－醋酸－水＝３：１：１,显色剂为１％茚三酮丙酮液）对Ｐ－ＡＰＭ进行检测,实验结果表明,Ｐ－ＡＰＭ与以嗜热蛋白酶催化合成的Ａｓｐａｒｔａｍｅ中间产物极为相似。不同来源的木瓜蛋白酶由于其酶活力不同,对Ｐ－ＡＰＭ的合成和水解能力也有差异,选择国产的木瓜蛋白酶合成Ａｓｐａｒｔａｍｅ,为酶法合成二肽甜味剂提供了可探讨的途径。     

分枝杆菌多糖的制备及对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

目的:制备分枝杆菌多糖并考察其对小鼠淋巴细胞增殖的影响。方法:用苏通培养基培养分枝杆菌,菌体脱脂后,用5种方法提取,比较多糖得率,并用正交试验优化超声提取工艺,再用稀碱提取残渣,粗多糖经Sevag法除蛋白、DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱纯化后得到分枝杆菌多糖;用MTT法检测分枝杆菌多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果:超声后热水提取多糖得率最高,超声提取的优化工艺是提取时间40 min,固液比为1∶150,超声功率600 W;单因素试验优化的Sevag法除蛋白条件为体积比1∶5,萃取时间为20 min,萃取6次;提取得到的4种多糖组分在6.25~50 mg.L-1范围内均能显著促进脾淋巴细胞的增殖。结论:用本实验工艺成功制备了分枝杆菌多糖,制备物具有刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的作用。     

口服新型降糖多肽ODA的设计及其口服降糖活性

肠促胰岛素分泌肽胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽(GIP)能通过血糖依赖机制促进胰岛素分泌,其特异性结合受体GLP-1R和GIPR是治疗2型糖尿病的良好靶点。以本实验室前期设计的口服降糖多肽OHP2为基础,设计了可口服的新型降糖多肽——ODA。ODA较OHP2的亲脂性提高,在Caco-2细胞中的胞吞能力及跨细胞转运能力更强。ODA保留了OHP2对GLP-1R的激活能力,增强了与GIPR的结合能力。口服低剂量ODA(0.53 mg/kg)即可达到与口服OHP2(1.06 mg/kg)相当的降糖水平。研究结果显示,ODA是治疗2型糖尿病极具潜力的口服药物。     

聚乙二醇化Exendin-4类似物受体亲和力测定方法的建立

基于荧光素酶报告基因法和本实验室前期构建的CHO-GLP-1R-CRE-Luc⁺检测模型细胞株,建立并优化了长效降糖多肽——聚乙二醇化Exendin-4类似物PE与GLP-1受体的亲和力测定方法,并对其进行了方法学验证。结果表明,当药物作用4 h,化学发光底物作用15 min,检测药物在5.7×10^-3~1.5×10³ nmol/L浓度区间内时,该检测方法的专属性和耐用性良好、准确度和精密度较高,符合《生物制品质量控制分析方法验证技术一般原则》的相关要求。本研究为该类GLP-1受体激动剂药物的快速评价与筛选奠定了基础。