雷帕霉素增强卵巢癌细胞系对顺铂敏感性的机制研究

目的：研究雷帕霉素对卵巢癌细胞系顺铂敏感性的影响,以及PI3K/AKT/mTOR信号通路（简称mTOR信号通路）与卵巢癌细胞系顺铂耐药的相关性;初探雷帕霉素增强卵巢癌细胞系顺铂敏感性的分子机制。方法采用CCK-8法检测卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP的耐药指数（resistance index,RI）、细胞增殖抑制率;采用克隆平板实验观察不同用药方案对卵巢癌顺铂非耐药细胞系及SKOV3细胞系两种细胞系克隆形成的影响;采用蛋白质印迹法（Western blot）检测两种细胞系的蛋白表达差异。结果①SKOV3/DDP细胞系的RI为6.10,属中度耐药。②在SKOV3细胞系中,顺铂联合雷帕霉素作用24 h、48 h后的细胞增殖抑制率明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）,两组间的72 h细胞增殖抑制率无明显的统计学意义（P＞0.05）;顺铂联合雷帕霉素作用于SKOV3/DDP细胞系24 h、48 h、72 h后的细胞增殖抑制率均明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）。③雷帕霉素联合顺铂作用于SKOV3细胞系4 h后,其克隆形成抑制率明显高于单用顺铂组,差异有统计学意义（P＜0.01）。④SKOV3/DDP细胞系比SKOV3细胞系p-mTOR、p-AKT的表达升高,而mTOR、AKT的表达则相似。⑤联合用药组比单用顺铂组的PARP断裂增加。⑥雷帕霉素作用SKOV3细胞系24 h ,BCL2表达下调,LC3B由LC3BⅠ向LC3BⅡ转化增加;在SKOV3/DDP细胞系中未发现这两种作用。结论①在体外培养条件下,雷帕霉素能增强SKOV3及SKOV3/DDP细胞系对顺铂的敏感性。②mTOR信号通路激活可能在卵巢癌细胞系顺铂耐药机制中起重要作用。③雷帕霉素增强SKOV3细胞系对顺铂敏感性的分子机制包括：增强顺铂所致的DNA断裂、下调抗凋亡蛋白BCL2及引起细胞自噬;雷帕霉素增强SKOV3/DDP对顺铂敏感性分子机制可能与增强顺铂所致的DNA断裂有关。     

炎症性细胞因子致肝脏缺血再灌注损伤和丹参单体的保护作用

目的：探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素8（IL－8）在肝脏缺血再灌注损伤中的变化以及水溶性丹参单体MP－1（简称MP－1）的作用。方法：建立人肝窦内皮细胞体外低温缺氧再氧化模型和大鼠离体肝脏缺血再灌注损伤模型，以台盼蓝染色观察细胞损伤情况，用放免法分析透明质酸吸收率来反映肝AST、LDH的变化反映肝脏功能。结果：低温缺氧再氧化期间，肝窦内皮细胞的死亡率随着时间的增加而增加，TNF-α和IL－8的释放也随之增加，但肝窦内皮细胞的功能下降；肝窦内皮细胞死亡率分别与TNF-α与IL－8的释放呈正相关（r=0.949,P<0.05和r=0.892,P<0.05)。加入TNF-α抗体低温缺氧再氧化6h的内皮细胞死亡率降低；重组TNF-α处理的肝窦内皮细胞死亡率明显增加；离体大鼠肝脏的功能随低温保存和再灌注时间的增加而降低；MP－1能明显降低人肝窦内皮细胞的死亡率及TNF-α和IL－8的释放，同时可以减轻离体大鼠肝脏的缺血再灌注损伤。结论：TNF-α直接参与肝窦内皮细胞的缺血再灌注损伤，MP－1可能通过抑制TNF-α和IL－8的途径来减轻肝脏缺血再灌注损伤。     

我国藏族和汉族儿童少年维生素D营养状况

[目的]探讨我国藏族和汉族8～18岁儿童少年维生素D营养状况。[方法]采用随机整群抽样,随机抽取四川省阿坝藏羌自治州718名8～18岁的藏族和汉族儿童少年,各年龄各民族各性别为20人左右,由英国IDS公司生产的酶标试剂盒测定3月底的血清25羟维生素D(25(OH)D)浓度。[结果]研究对象平均年龄(12.8±3.0)岁,男、女生血清25(OH)D浓度平均为(38.7±17.2)nmol/L和(31.3±16.6)nmol/L。血清25(OH)D浓度与民族无关,而受年龄的影响,且男生高于女生。男女生维生素D缺乏率(血清25(OH)D﹤25nmol/L)分别为22.5%和48.3%,女生高于男生(χ2=45.9,P﹤0.01)。[结论]我国8～18岁藏族和汉族儿童少年维生素D营养状况受年龄和性别影响,冬春季交替时维生素D缺乏率较高。     

肿瘤患者T细胞核仁嗜银蛋白和辅助性T细胞亚群变化

目的探讨肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞核仁嗜银蛋白(AgNORs)表达和辅助性T(Th)细胞亚群变化的关系及其临床意义.方法采取肿瘤患者86例、正常对照者44例的外周血.PBMC经多克隆T细胞活化剂刺激,用图像分析法检测AgNORs区面积与细胞核仁面积的百分比(I.S%);PBMC用离子霉素和佛波醇酯活化5 h后,以酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测IFNγ和IL-4产生细胞的频度(%);用相同的活化剂刺激24 h,用ELISA试剂盒检测培养上清液中的γ-干扰素(IFNγ)和白细胞介素-4(IL-4)水平.结果肿瘤患者和正常人,AgNORs表达分别为4.9±1.2 I.S%和7.82±1.28 I.S%,肿瘤组显著下降(P＜0.05);肿瘤组PBMC中Th2细胞频度显著上升,Th1/Th2比值显著下降;同时,肿瘤组PBMC产生IFNγ和IL-4水平发生相应变化,变化方式与Th亚群变化相似;系统分析51例肺癌,转移组比未转移组,复发组比未复发组,Th1细胞数、Th1/Th2和IFNγ产生水平显著下降;在肿瘤组AgNORs表达与Th1细胞频度、Th1/Th2、IFNγ产生和肿瘤患者生活状态的Kamofsky评分正相关.结论肿瘤患者PBMC中T细胞表达AgNORs下降,与患者Th1细胞功能下降呈正相关,与临床状态变化一致.     

冷冻治疗小鼠Lewis肺癌及其对免疫功能影响的实验研究

目的:探讨冷冻外科以及冷冻配合免疫疗法控制小鼠Lewis肺癌的效果.方法:将小鼠Lewis肺癌细胞株接种至C57BL/6小鼠皮下.当肿瘤长至直径0.5±0.1 cm时,随机分为四组,分别是A组(冷冻组)、 B组(免疫组)、C组(冷冻配合免疫组)、D组(对照组).观察治疗后小鼠肿瘤体积变化和存活期.另外,对治疗后10 d小鼠进行NK细胞活性检测,判断冷冻外科对小鼠免疫机能的影响.结果:冷冻治疗后,Lewis肺癌体积在1周内出现明显缩小.术后21 d,A、B、C及D组的平均肿瘤体积分别是1.00、1.26、0.35和2.85 cm3.A、B、C及D组的存活期分别是52.1 d±3.22 d、33.5 d±2.07 d、69.9 d±7.58 d及29.1 d±1.79 d.C组及A组的存活期均明显优于D组(两组比较均为P<0.05).另外,术后10 d C组小鼠NK活性为41.4%,均明显高于D组(P<0.01).而A组小鼠NK活性和D组无明显差别.结论:冷冻外科可以有效地控制Lewis肺癌的生长,延长荷瘤小鼠存活期.冷冻配合IL-2协同治疗更加有效提高围手术期NK细胞活性.     

光磁双模态探针钆-[4,7-双-羧甲基-10-(2-荧光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-乙酸络合物合成方法的改进

目的:改进光磁双模态分子探针钆-[4,7-双-羧甲基-10-(2-荧光素硫脲乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]-乙酸络合物(Gd-DO3A-EA-FITC)的合成及纯化方法。方法:1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTA)经过取代反应、水解反应、偶联反应、与金属络合反应,合成Gd-DO3A-EA-FITC。结果:改进了Gd-DO3A-EA-FITC的合成路线,分别通过取代反应、水解反应、偶联反应、络合反应得到了光磁双模态分子探针,该反应总收率为34.6%,与原路线(18.0%)相比,总收率增加,各化合物通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和质谱分析法鉴定后结果正确。改进后的路线避免了取代反应不易控制的缺点,且在纯化分离方面,将载样量少、成本高的制备型高效液相色谱纯化改进为载样量多、简便易操作的柱色谱。结论:改进后的路线改善了反应条件的可控性,并且使化合物纯化分离过程变得更加简易,同时使总收率明显提升。光磁双模态探针可同时将活体磁共振成像与离体光学成像相结合,实现光磁双重同步检测,使二者的检测结果相互验证。可将光磁双模态分子探针应用于脑结构及其功能相关研究,并且经静脉途径给药后可以对脑肿瘤进行研究,因此在脑肿瘤和脑血管相关疾病的药物治疗中能够发挥重要的作用。     

血管内皮生长因子受体抑制剂对小鼠支气管哮喘模型气道炎症和气道重塑的影响

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂对变应性气道炎症和气道重塑的影响,阐明VEGF与支气管哮喘(简称哮喘)以及气道重塑的关系。方法BALB/c小鼠按随机数字表法分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、VEGF受体抑制剂治疗组(C组),每组各10只。用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清中VEGF进行定量分析;用免疫组化法检测VEGF在小鼠肺组织内的表达水平。采用医学图像分析软件测定支气管管壁厚度(WAt/P i)、支气管平滑肌厚度(WAm/P i)、支气管平滑肌细胞计数(N/P i)及肺组织切片中的血管计数、血管壁平滑肌厚度、血管壁平滑肌细胞计数。结果BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞比值B组分别为(142±63)×107/L、98.0±46.9,A组分别为(30±14)×107/L、0.7±1.1,C组分别为(41±17)×107/L、4.9±3.5,A组和C组BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞比值分别与B组比较差异有统计学意义(P均<0.01)。B组BALF中上清液和血清中VEGF水平分别为(55±26)pg/m l、(72±26)pg/m l,A组分别为(37±9)pg/m l、(49±18)pg/m l,C组分别为(34±3)pg/m l、(43±19)pg/m l,A组与B组、C组与B组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。免疫组化结果显示,B组大部分支气管平滑肌、黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管周围VEGF均呈阳性表达,而A组和C组几乎没有VEGF的表达。图像分析显示,B组WAt/P i、WAm/P i、N/P i分别为(17±5)μm2/μm、(6.3±2.2)μm2/μm、(0.050±0.020)个/μm,A组分别为(8±3)μm2/μm、(3.2±0.8)μm2/μm、(0.027±0.017)个/μm,A组与B组比较差异有统计学意义(P分别<0.01、0.05)。B组和A组血管计数分别为(19±3)个、(10±5)个,A组与B组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。经抑制剂治疗后C组WAm/P i、血管计数分别为(4.5±1.3)μm2/μm、(11±3)个,C组与B组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论VEGF在小鼠哮喘模型气道及肺内过度表达,并参与了哮喘的发病和气道重塑过程。VEGF受体抑制剂可明显改善哮喘小鼠的变应性气道炎症和气道重塑的病理生理过程。     

PAI-1基因多态性对支气管哮喘气道重塑影响的研究

目的 探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)基因启动子-675 4G/5G多态性对支气管哮喘(简称哮喘)气道重塑的影响.方法 将慢性持续期哮喘患者(30例)和健康人(20名)分列为哮喘组和对照组,提取所有受试者全血DNA,用等位基因特异性PCR(ASO)法测定PAI-1启动子区域-675位点多态性,酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血浆PAI-1、血浆转化生长因子β1(TGF-β1)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平,高分辨率CT(HRCT)观察所有受试者肺部影像学特征,运用PickerPQ6000分析软件测定气道壁厚度(T)、气道壁面积(WA),采用气道壁厚度/气道外径(T/D)和气道壁面积占气道总面积百分比(WA%)作为标化指标.结果 WA轻度哮喘组(13.27±4.06) mm2和中重度哮喘组(13.86±4.88) mm2与健康对照组(9.43±3.70) mm2比较,有统计学差异(P均<0.05),但轻度哮喘组和中重度哮喘组差异无显著性(P=0.768).WA%值轻度哮喘组(71.30±6.55)%和中重度哮喘组(72.03±8.34)%,与对照组(66.24±5.19)%比较显著增加(P均<0.05);轻度哮喘组与中重度哮喘组之间无统计学意义.T、T/D差异无显著性(P=0.857,P=0.967).血浆TGF-β1中重度哮喘组(69.86±11.71) pg/ml显著高于轻度哮喘组(59.40±11.35) pg/ml和对照组(59.29±13.53) pg/ml(P<0.05),但轻度哮喘组和对照组之间差异无显著性(P=0.981);血浆MMP-9水平对照组、轻度哮喘组、中重度哮喘组之间无统计学差异(F＝0.388,P＝0.68).4G/4G、4G/5G和5G/5G基因型表达的TGF-β1、T和WA%差异有统计学意义(P<0.05).血浆PAI-1仅与血浆TGF-β1存在相关关系(r＝0.335,P<0.05),与T、T/D、WA和WA%无相关关系(P>0.05).多元方差分析显示PAI-1基因多态性、血浆TGF-β1、血浆PAI-1水平与PAI-14G/5G基因多态性的交互作用对气道重塑表型的影响有统计学意义(P=0.059,P=0.026,P=0.030).结论 哮喘患者存在气道壁增厚、气道壁面积增加等气道重塑表现.PAI-1启动子4G/5G多态性可能是哮喘气道重塑的独立影响因素之一.     

SB203580对烟雾暴露的哮喘大鼠的影响

目的建立烟雾暴露的支气管哮喘(简称哮喘)大鼠模型,观察p38有丝分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)抑制剂SB203580对其的治疗作用。方法将Wistar大鼠随机分为4组,即正常对照组、哮喘组、烟雾暴露的哮喘组及SB203580干预组。动物肺功能仪测定大鼠呼气阻力、吸气阻力及肺顺应性,观察肺组织病理学改变,通过ELISA检测大鼠肺组织中IL-4、IL-5和IL-8的表达。结果与烟雾暴露的哮喘组相比,SB203580干预组大鼠的气道阻力显著下降,肺顺应性显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);气道炎症明显减轻;肺组织中IL-4、IL-5和IL-8的含量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 p38 MAPK抑制剂SB203580可以改善烟雾暴露的哮喘大鼠的气道炎症,减轻其支气管收缩反应。