RNA斑点印迹法检测人食管癌DNA聚合酶β的基因表达

目的 :探讨人食管癌组织DNA聚合酶 β(polβ)RNA水平的表达。 方法 :提取 5 1例食管癌患者的手术标本组织 ,包括 :17例癌灶组织 ,17例癌旁组织 ,17例“正常”组织细胞总RNA ,以生物素标记的polβcDNA探针进行RNA斑点印迹。结果 :DNApolβRNA水平的表达癌组织高于癌旁组织 (P <0 .0 5 ) ,癌旁组织高于“正常”组织 (P <0 .0 5 ) ,癌组织高于“正常”组织 (P <0 .0 1)。结论 :人食管癌组织及癌旁组织的DNApolβ基因RNA水平表达显著高于“正常”组织 ,提示DNApolβ的过表达可能在食管癌的发生、发展中起 作用。     

8-Br-cAMP和槲皮素单独和联合应用对Eca-109细胞POLB及多药耐受相关蛋白的影响

目的探讨8-Br-cAMP和槲皮素单独和联合应用对Eca-109细胞耐药性的影响.方法将培养的Eca-109细胞随机分为4组①8-Br-cAMP组(Br组); ②槲皮素组(Q组); ③(Br+Q)组; ④不加药物的对照组(C)组.同时培养48 h,对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜(NCM)滴膜2种标本,分别进行MRP和POLB的免疫组化染色和免疫斑点印迹阵列及TLC扫描.结果免疫组化染色显示 C组的MRP-IR、POLB-IR强于Br组、Q组或(Br+Q)组,P<0.01.TLC扫描OD值C组MRP-IR高于Br、Q(Br+Q)组约3倍;POLB-IR高于Br、Q或(Br+Q)组约2倍;MRP与POLB呈显著正相关r=0.983 8,P<0.01.结论8-Br-cAMP和槲皮素联合用药或单独用药均可降低Eca-109细胞的多药耐受性而提高药物的敏感性,可有利于提高临床疗效.     

原位DNA结合蛋白显示技术的改进

目的：探讨DNA结合蛋白定位技术的改进。方法：以左旋咪唑／酒精先消除细胞的内源性碱性磷酸酶(AP),再分别以DNase和RNase消除细胞内源性核酸,应用低盐浓度的杂交液预杂交后再加特异DNA的标记探针,以链霉亲和素SA-AP中介,最终以四氮唑盐／5溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT／BCIP)作为底物,37℃下显色。结果：DBP阳性信号呈紫色细颗粒。主要定位于胞核。结论：此DNA结合蛋白的改进技术定位清晰且染色过程迅速。     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白及其mRNA表达的影响

目的应用Southwestern技术研究8-Br-cAMP和槲皮素(quercetin)对Eca-109细胞DNA结合蛋白与p16基因启动子区的结合调控mRNA表达的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.同时培养48 h,应用质粒提取及限制性酶切回收目的DNA片段,采用生物素随机引物标记探针;应用DNA斑点印迹技术检测探针的灵敏度后以Southwestern印迹技术检测与p16基因启动子区特异性结合的DNA 结合蛋白(DBP);以原位杂交检测p16基因mRNA的表达情况.结果实验组条带强于对照组,Br组强于Q组;核基质DNA结合蛋白主带位于Mr66 000、58 000和20 000;核外DNA结合蛋白主带位于Mr40 000、28 000和20 000;2者中20 000是共同成分.原位杂交技术显示p16基因mRNA蓝紫色信号颗粒位于胞质,杂交信号以实验组较强.结论8-Br-cAMP和quercetin尤其是前者作用于人食管癌Eca-109细胞,诱导产生与p16基因启动子结合较强的DBP,启动p16基因表达.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞核基质蛋白的影响

目的探讨8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞核基质蛋白的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.同时培养48 h,应用SDS-PAGE技术分析3组细胞核基质蛋白成分.结果实验组(Br组与Q组)与对照组(C组)比较,相对分子质量64 000、66 000、58 000为增加的条带,14 000、17 000、18 000为增强的条带,92 000是减弱的条带.2个实验组相比,以Br组变动显著.结论8-Br-cAMP和槲皮素可以诱导Eca-109细胞核基质蛋白成分改变,可能对肿瘤细胞基因表达调控、分化及凋亡起重要作用.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞内游离钙离子浓度的影响

目的观察8-Br-cAMP和槲皮素对人食管癌Eca-109细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48 h,用激光共聚焦显微镜观察3组细胞内钙离子的荧光强度.结果对照组细胞内游离钙离子荧光强度为59.2±8.1,Br组细胞内游离钙离子荧光强度为63.3±8.5,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);Q组细胞内游离钙离子荧光强度为113.3±12.5,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论提示Br和Q诱导细胞凋亡的信号传导途径可能存在一定差异.     

8-Br-cAMP对Eca-109细胞c-myc，wtp53，iNOS基因和EGFR表达的影响

目的探讨8-Br-cAMP对Eca-109细胞c-myc、wtp53、iNOS基因和EGFR表达的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分为2组①实验组加8-Br-cAMP至终浓度为2×10-5mol/L,培养24 h;②对照组不加8-Br-cAMP,培养24 h.对2组的细胞涂片和硝酸纤维素膜(NCM)标本进行c-myc、wtp53、iNOS基因和EGFR表达检测,并对扫描数值进行统计学处理.结果原位杂交及免疫组化反应信号皆定位于Eca-109细胞的胞质,扫描数值显示①c-myc mRNA实验组为3.38±0.99,对照组为5.18±1.39;②wtp53 mRNA实验组为2.74±0.83,对照组为0.38±0.27;③iNOSmRNA实验组为4.52±0.74,对照组为2.63±0.13;④EGFR-IR实验组为2.37±1.05,对照组为4.38±0.48.以上实验组与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05).结论c-myc、wtp53和NO均可参与8-Br-cAMP诱导癌细胞的分化效应.     

纳米脂质体槲皮素联合8-Br-cAMP对人Rb44细胞组蛋白脱乙酰化酶抑制效应的探讨

目的探讨纳米脂质体槲皮素(nanoliposomal quercetin,nLQ)联合8-Br-cAMP对培养的人Rb44细胞组蛋白脱乙酰化酶的抑制效应。方法将培养的Rb44细胞分为4组:nLQ组,以40μmol·L-1nLQ培养;8-Br-cAMP组:以20μmol·L-18-Br-cAMP培养;nLQ+8-Br-cAMP组;以40μmol·L-1nLQ和20μmol·L-18-Br-cAMP共培养;对照组:不加nLQ或8-Br-cAMP。应用MTT实验检测细胞生长抑制率(GSR)。应用免疫斑点印迹检氉测脱乙酰化酶抑制物、NF-κBp65、磷酸化IκBα及c-myc的表达。对表达的靶信号以图像分析仪扫描灰度值。结果与对照组相比,nLQ组和8-Br-cAMP组GSR达44%±1%和40%±1%,均为P<0.05;nLQ+8-Br-cAMP组GSR达60%±1%,P<0.01。nLQ组、8-Br-cAMP组、nLQ+8-Br-cAMP组与对照组相比,脱乙酰化酶抑制物、NF-κBp65及c-myc的表达均减低,均为P<0.05;而磷酸化IκBα的表达均增强,均为P<0.05。结论 nLQ联合8-Br-cAMP可下调脱乙酰化酶抑制物表达,上调磷酸化IκBα的表达同时可抑制NF-κBp65的表达。     

人消化系肿瘤染色质非组蛋白电泳图谱分析及免疫原性研究

从人食管癌、胃癌、直肠癌、肝癌及胎儿肝和从距癌>5cm的癌旁作为对照组织的细胞核中,分别用0.4MNaCl盐提法、苯酚提取法和羟基磷灰石柱层析法提取染色质非组蛋白蛋白质,简称非组蛋白(NHP)进行电泳图谱分析并将不同方法提取的癌NHP作为抗原制备免疫血清做对比免疫组化反应。结果表明①用0.4MNaCl盐提之NHP的质和量更适于作为抗原制备免疫血清和进行免疫组化染色。②以上各种肿瘤NHP与其癌旁NHP之间均有质和量的差异。③不同肿瘤NHP具有组织特异性,然而各种瘤之间也具有相似的共性,即癌NHP之多加带主位于6万d～9万d;多变带区主位于4万d上下处(肝癌NHP之多变带区主位于5万d及8万d);而且肝癌NHP与胎肝NHP有相似处。结果提示癌NHP之多加或加深带可能与癌基因表达的激活有关;而缺如或减弱带可能与载有抗癌基因的染色体区带丢失或基因表达改变有关。     

耳针对生长因子及ACTH的效应

大鼠颌下腺为表皮生长因子（ＥＧＦ）的主要来源之一。ＥＧＦ可刺激垂体分泌ＡＣ－ＴＨ。将大鼠分组为针刺与唾腺相关之“腮腺”耳穴组，针刺与垂体相关之“脑点”耳穴组和不施加针刺的对照组。测定痛阈并分别以原位杂交和免疫组织化学技术探测颗粒曲管（ＧＣＴ）细胞的ＥＧＦ ｍＲＮＡ、ＥＧＦ受体（ＥＧＦＲ）－免疫反应性（ＩＲ）及ＥＧＦ－ＩＲ垂体ＡＣＴＨ－ＩＲ。结果显示针刺后ＥＧＦ ｍＲＮＡ及ＥＧＦＲ－ＩＲ提高；而ＥＧ