BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨连续培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)最佳标记时间、剂量。方法 差速贴壁法对SD鼠MSCs进行体外传代培养;第6代细胞行流式细胞仪鉴定细胞的表面抗原;以终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU检测最佳标记剂量;在细胞生长融合前72、48、36、24、12、3h加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,并分别孵育至细胞融合,测定BrdU的标记率,找出最佳标记时间;免疫组化分析BrdU标记率。结果 流式细胞仪检测所标记的细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,并且连续传5代均可检测到。结论 传代后贴壁生长的梭形细胞为MSCs,终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,且可以连续检测到,提示BrdU标记可用于MSCs移植入体内后存活、生长和分化的动态观察。     

核黄素反应性脂质沉积性肌病临床特征与基因突变分析:两家系三例报告并文献复习

目的分析核黄素反应性脂质沉积性肌病临床特征和基因型,以实现早期诊断与治疗。方法与结果两家系3例核黄素反应性脂质沉积性肌病患者主要表现为进行性呼吸肌、四肢近端肌无力,肌电图呈肌源性损害,油红O染色肌纤维内可见脂肪滴沉积。3例患者均存在电子转移黄素蛋白脱氢酶(ETFDH)基因突变,分别为c.250GA(Ala84Thr)纯合突变和c.250GA(Ala84Thr)、c.524GA(Arg175His)复合杂合突变。维生素B2治疗后症状明显改善,1例治疗10个月后呼吸肌和四肢近端肌无力症状完全消失,恢复正常运动功能;1例治疗2个月后行走、跑步如常,颈部肌肉恢复至正常状态;1例治疗2个月后可参加剧烈运动且无疲劳感。结论核黄素反应性脂质沉积性肌病虽然以四肢近端和躯干肌无力,以及运动不耐受为主要表现,但也需注意少数以呼吸肌无力为首发症状的病例,避免漏诊和误诊。维生素B2单药治疗效果极佳,症状可明显好转或痊愈。因此,临床疑似核黄素反应性脂质沉积性肌病患者可尝试维生素B2诊断性治疗。     

孪生子患单纯型遗传性痉挛性截瘫的临床与卵型鉴定

目的研究孪生子患单纯型遗传性痉挛性截瘫（HSP）的临床特征与卵型鉴定。方法对一对患单纯型HSP孪生兄弟的临床特点和症状进行分析并跟踪随访，同时作孪生子卵型鉴定。结果（1）孪生子均缓慢起病，步态不稳，下肢笨拙，上下楼困难，逐渐发展为双下肢痉挛性不完全性截瘫；（2）下肢肌张力增高，肌力Ⅳ级，腱反射亢进，髌、踝阵挛阳性，Babinski征阳性，屈性病理反射阳性；（3）16个STR位点的等位基因均相同，提示为同卵双生。结论孪生子同患单纯型HSP的临床特点与一般HSP无异，作16个STR位点的PCR可快速、准确地鉴定孪生子的卵型。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的逆转化现象

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞后的逆转化现象.方法 从成人骨髓分离、培养和扩增hMSC.用参芪液诱导hMSC分化为神经元样细胞,并用免疫组化方法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.采用RT-PCR方法检测10个基因(内胚层基因ceruloplasmin;中胚层基因SM22:外胚层基因Amyloid precursor protein、syntaxin;生殖系基因protamine;神经元特异性基因Neuro D、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化为神经元样细胞的动态变化以及逆转化细胞的基因表达变化.结果 hMSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞.免疫组化显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性,GFAP阴性.去除参芪液,观察到神经元样细胞又恢复为hMSC的外形,呈现宽大扁平或长梭形.基因检测显示逆转化的细胞基因表达与未分化hMSC相似.结论 参芪液可以促进hMSC分化为神经元样细胞,诱导分化过程可以出现逆转化现象.     

用基因缺陷、蛋白质空间结构改变浅析Duchenne型肌营养不良症发病机制

目的：研究dystrophin基因缺陷、蛋白疏水性改变和空间结构改变与临床表型的关系，从分子水平探索Duchenne型肌营养不良症（DMD）发病机制。方法:分析59例缺失型突变的DMD/BMD患者基因检测结果，以信息生物学方法分析dystrophin蛋白疏水性和三维结构改变与临床表型的关系。结果:50例移码突变均为DMD。累及第3疏水峰的5例整码突变4例为DMD，1例BMD。3号外显子缺失后dystrophin的氨基端空间位置发生扭转，影响dystrophin与肌钙蛋白结合而致病。结论:肌营养不良的临床表型轻重与缺失是否破坏阅读框、累及第3疏水峰以及蛋白空间结构改变有关。     

成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程的动态变化

目的 探讨成肌调节因子MyoD与myogenin在肌肉损伤修复过程中的动态表达。方法 用盐酸布比卡因局部注射制作肌肉损伤模型，在损伤后不同时间点取腓肠肌行冰冻切片，HE染色显示损伤肌肉的病理变化，用SABC法检测MyoD与myogenin的表达。结果 MyoD在肌肉损伤后18h开始表达，48h达高峰；myogenin在肌肉损伤后24h开始表达．72h达高峰。结论 MyoD与myogenin在肌肉损伤后的再生修复过程中起作用，可作为鉴定肌肉前体细胞和反映肌肉再生的指标。     

Micro-dsytrophin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理改变及micro-dystrophin的表达

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(mMSCs)携带micro-dystrophin基因在移植鼠体内分化为有功能肌细胞的可能性。方法采用脂质体介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠mMSCs,通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后不同时间点对腓肠肌进行HE染色、计数核中心移位纤维(CNF)比例,并用免疫荧光法检测micro-dystrophin的表达。结果移植后各时间点腓肠肌病理改变较对照组有所改善,CNF比例下降,差异有统计学意义,部分肌细胞膜能表达micro-dystrophin蛋白,并随移植时间延长micro-dystrophin阳性肌纤维比例增加,分别达到3%(8周时)、6%(12周时)和8%(16周时)。结论自体mMSCs可携带外源性micro-dys-trophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞。     

脐血干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症

目的比较假肥大型肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)患者经脐血干细胞移植治疗前后其肌肉再生、抗肌萎缩蛋白表达和运动功能的改变;以及评价治疗的安全性。方法对1例经基因分析和肌肉活检及抗肌萎缩蛋白检测确诊的、已丧失行走能力的DMD患儿,经HLA配型,在脐血库中寻找到一个全相合的脐血供体。采用白消安+环磷酰胺+兔抗胸腺淋巴细胞球蛋白预处理后进行异基因脐血干细胞移植;术后采用环孢素A和骁悉方案预防移植物抗宿主反应(graftversushostreaction,GVHD)。同时定期检测原发病的生化指标如血清肌酸激酶(creatinekinase,CK)、造血重建的植入证据(血型转变、肌肉和血液系统的聚合酶链反应短串联重复序列分析)、缺陷基因是否纠正、新生肌肉是否出现、肌肉中抗肌萎缩蛋白是否表达和运动功能是否改善。结果(1)中性粒细胞在脐血干细胞移植后第15天(+15天)达到0.5×109/L,白细胞在+25天达正常水平;血小板于+22天达到20×109/L;血红蛋白维持于85～100g/L。术后140天骨髓穿刺提示三系生长旺盛;(2)移植后140天血型转为供体AB型。至今没有出现移植物抗宿主反应。(3)术后18天、30天、43天、55天、74天、233天患者外周血DNA和术后140天、183天、235天骨髓细胞DNA经PCRSTR检测为供者独立植入;(4)患儿术后60天取外周血做基因分析,显示19号缺失的外显子得到完全纠正,患儿转变为正常基因型;(5)患儿在移植后75天的肌肉活检可见新生肌管形成,抗肌萎缩蛋白免疫组化呈弱阳性,少数为强阳性反应,DNA分析:供者基因DNA占1%～13%;移植后126天抗肌萎缩蛋白免疫组化检测显示阳性的肌纤维明显增多,供者基因DNA上升至2.5%～25%;(6)患儿血清CK从移植治疗前的5735U/L降至274U/L;(7)术后100天体检发现患儿肌力略有改善,肢端温暖。结论异基因脐血干细胞移植治疗DMD,可在移植后短期内重建造血功能、血清CK显著下降、肌肉抗肌萎缩蛋白表达,患儿运动有所改善,提示造血干细胞移植将有益于DMD的治疗。     

基于广州市计生网络的唐氏综合征群体干预模式的建立与管理

目的:充分发挥广州市人口和计划生育三级服务网络的优势,探索建立政府主导、计生牵头、计卫联合、多部门配合的主动全程管理与服务的干预模式进行唐氏综合征的筛查及产前诊断,拟求达到全面降低唐氏综合征患儿出生率的目的。方法:自2007年9月起依托于广州市人口和计划生育三级服务网络,计卫联合,先后在黄埔区、番禺区及增城市进行中孕期孕妇唐氏综合征的群体干预。结果:基于计生网络的唐氏综合征干预模式已基本建立,至2009年12月底,共筛查孕妇9542人,人群筛查率76%,阳性率6.46%,高风险孕妇产前诊断率66.61%,诊断出唐氏综合征及18三体胎儿8例,各种重大出生缺陷76例,均知情同意引产。产后随访率达100%,出生唐氏患儿2例。结论:政府主导、计生牵头、计卫联合、多部门配合的主动全程管理与服务的干预模式可使唐氏综合征干预实现筛查人群及产前诊断最大化,从而达到了降低广州地区唐氏综合征患儿出生的目的。     

经micro-dystrophin基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 探讨携带micro-dystrophin基因的自体骨髓间充质干细胞(mMSCs)在移植鼠体内分化为有功能肌细胞的可能性.方法 采用逆转录病毒介导micro-dystrophin 基因转染mdx小鼠MSCs(mMSCs),通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后不同时间点并检测血清激酶(CK)值,对腓肠肌进行HE染色、计数核中心移位纤维(CNF) 比例,并用免疫荧光法,、逆转录-聚合酶链反应、Western blot检测测micro-dystrophin 的表达.结果 移植后各时间点血CK值下降,腓肠肌病理改变较对照组有所改善,CNF比例下降,差异有统计学意义,部分肌细胞膜能表达micro-dystrophin 蛋白,并随移植时间延长micro-dystrophin阳性肌纤维比例增加,分别达到1 %(8周时)、7 %(12周时) 和15%(16周时).RT-PCR和Westernblot也发现,随着移植时间的延长,micro-dystrophin表达增加.结论 自体mMSCs可携带外源性micro-dystrophin 基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin 阳性肌细胞.