HSV-1 VP22及microdystrophin基因融合表达重组质粒的构建及其生物学特性的初步研究

目的 构建人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒蛋白22(VP22)及microdystrophin基因融合表达重组质粒,体外研究其表达及HSV-1 VP22介导的蛋白转导特性,为进一步利用此重组质粒治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)奠定基础.方法 从质粒pSINrep5-VP22中PCR扩增HSV-1 VP22全长基因.然后克隆至真核表达载体pAVX1中,构建重组质粒pAVP22:再用Not I酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入质粒pAVP22中,获得重组质粒pAVP22-MICDYS:然后将重组质粒pAVP2-MICDYS转染至小鼠成纤维细胞3T3细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光检测microdystrophin基因的转录及蛋白表达;最后收集转染后3T3细胞上清,感染人间充质干细胞(MSCs),检测重组蛋白在人MSCs中的表达情况来分析HSV-1 VP22是否可以介导VP22-microdyslrophin融合蛋白的转导.结果 成功构建了含有HSV-1 VP22和microdystrophin基因的重组质粒.并在体外得到了很好表达:同时也证实HSV-1 VP22提高了microdystrophin基因在3T3细胞中的表达效率,并可介导VP22-mizrodystrophin蛋白从3T3细胞到人MSCS间的转导.结论 该重组质粒的构建及体外成功表达和蛋白转导特性的确定为下一步用该重组质粒进行DMD疾病治疗研究奠定了基础.     

多重PCR联合DHPLC诊断21三体综合征方法的建立

目的初步建立多重PCR联合DHPLC技术检测21-三体综合征的方法。方法针对21号染色体上特异的3个STR位点(D21S1435、D21S1411、D21S11)设计引物,对100例外周血标本(其中25例21三体标本)提取基因组DNA进行多重PCR扩增,得到的PCR产物通过DHPLC仪进行结果分析。结果 DHPLC分析100例标本中21例为21-三体标本,其中20例21-三体标本的诊断结果与染色体核型分析结果一致,DHPLC技术检测21-三体异常灵敏度和特异度分别为80%,98.67%。结论 DHPLC技术诊断外周血标本结果与染色体核型诊断结果具有同一性,DHPLC技术可以对21三体综合症作出快速、较为准确的诊断。     

BDNF诱导骨髓间质干细胞分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系

目的：探讨脑源性神经营养因子（BDNF）体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）分化中神经元特异性蛋白表达与细胞凋亡的关系。 方法： 分别用BDNF和β-巯基乙醇（β-ME）诱导MSCs分化为神经元样细胞，在诱导1 h、6 h、12 h及24 h后用蛋白质印迹法检测神经元特异性蛋白（nestin、NSE、MAP-2及GFAP）的表达，同时用流式细胞仪检测各时点的细胞生长周期及细胞凋亡。 结果： 蛋白质印迹法结果显示β-ME和BDNF诱导的细胞均能表达神经元特异性蛋白：nestin和NSE，不表达MAP-2；神经胶质细胞特异性蛋白GFAP也有较弱表达。β-ME组诱导12 h后nestin的表达转为阴性，NSE表达也减弱，而BDNF组直至24 h nestin和NSE表达才渐转阴性；BDNF诱导的细胞S期百分率均较同时点的β-ME组高，β-ME在诱导后12 h出现了凋亡峰，BDNF诱导组在观察的时点内均未出现凋亡峰。 结论： β-ME诱导细胞的神经元特异性蛋白表达的减少与细胞凋亡在时间上一致，说明分化后细胞死亡的原因可能与凋亡有关；而BDNF诱导细胞的蛋白表达减少与细胞凋亡无关，提示BDNF诱导分化后的细胞死亡可能还与其它因素有关或者BDNF可能有抗凋亡作用。     

101例非缺失型α-地中海贫血基因分析

目的了解非缺失型α-地中海贫血的基因突变类型及构成比,以及其在临床检测的必要性。方法应用PCR-RBD技术和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对受检对象进行非缺失型α-地贫基因分析。结果 374例非缺失型α-地贫待排的受检者中有101例检测到携带该基因,其中ααQS/αα71例、ααWS/αα15例、ααCS/αα12例、ααQS/--SEA1例、ααCS/--SEA1例、ααQS/-α3.71例,大约27%受检者能确诊为非缺失型α-地贫携带。结论初步阐明非缺失型α-地贫的基因突变类型和构成比,提高了α-地贫检出率,为非缺失型a地贫基因检测必要性提供了理论依据。     

骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理变化

目的 研究骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌组织病理变化. 方法 7～9周龄mdx鼠20只平均分为4组,放射处理后移植1.2×107细胞/只同种异基因全骨髓干细胞,于移植后4、8、12及16周用HE染色观察腓肠肌组织细胞形态及核中心移位纤维(CNF).C57鼠和未治疗mdx鼠各5只作阳性和阴性对照. 结果 CS7鼠腓肠肌横切面可见肌细胞大小形态基本一致,无核中心移位现象.各细胞移植治疗组和阴性对照组mdx鼠均有大量的炎细胞浸润,核中心移位明显.未治疗mdx鼠CNF最高,约达70%;移植后4、12和16周,CNF分别为55%、50%和44%. 结论 骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌CNF随移植时间延长逐渐减少,提示骨髓干细胞移植后长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生.     

Dejerine—Sottas病一例

患者女，13岁．因进行性四肢无力、肌萎缩11年于2003年入院。患者出生时正常，2岁始学走路，以脚尖行走，并逐渐出现双足内翻，3岁时在当地医院行左足肌腱松解术后未能再行走。4岁渐出现双手无力．手指不能伸直，并向近端发展，直至出现双手曲屈畸形，肌电图示神经原性损害。患者自发病来无肌跳，无肢体疼痛麻木，无视物重影、头痛头晕等症状。患者足月顺产，父母均健康，非近亲结婚，有一弟．正常，家族中否认有类似患者。     

依托人口和计划生育体系建立地中海贫血群体干预模式的实践与体会

目的 依托人口和计划生育服务体系建立地中海贫血(简称地贫)的群体干预模式,达到大幅降低重型地贫患儿出生的目的.方法 以广州黄埔、番禺、增城和天河待孕、已孕夫妇为干预对象,依托人口计划生育公共服务体系进行地贫的宣教、筛查、督促高风险家庭产前诊断及随访的全程管理与服务.结果 试点区建立以人口计生服务体系为主体的地贫宣教、筛查、产前诊断及随访网络,试点2年共有10 695个家庭参与筛查,确诊重症地贫胎儿16例,随访8360例新生儿无重症地贫患儿.结论 依托人口和计划生育服务体系可建立有效的地贫干预模式,实现地贫的主动全程群体干预.

Abstract：

Objective To set up thalassemia population intervention model in order to decrease the birth of thalassemia major, relying on population and family planning service system. Methods Pregnant women and their husbands were educated about thalassemia, and participated in screening and prenatal diagnosis if the couple were carriers of thalassemia in the areas of Huangpu, Panyu, Zengcheng and Tianhe districts of Guangzhou. Results The network of thalassemia intervention mainly dependent on family planning service system was set up in these regions. A total of 10 695 families participated in thalassemia screening and 16 thalassemia major fetuses were diagnosed in the last two years. No one was thalassemia major in the 8360 newborn. Conclusion Thalassemia population intervention model was set up relying on family planning service system and it significantly decreased the birth of thalassemia major.     

高效液相色谱法诊断地中海贫血的阈值探讨

目的探讨高效液相色谱法(HPLC)诊断地中海贫血的HbA;2和HbF最佳阈值,提高HPLC诊断地贫携带者特异性,减少漏诊与误诊。方法病例组收集平均红细胞体积(MCV)≤82fl和/或平均红细胞血红蛋白含量(MCH)≤26pg的EDTA;2K2抗凝血2272份;对照组收集MCV>82fl,MCH>26pg抗凝血1903份。用HPLC方法测定血红蛋白亚型HbA;2和HbF含量;对HbA;2≤2.5%血样进行α地中海贫血常见缺失型基因检测,对HbA;2≥3.5%和/或HbF≥2.3%血样采用反向点杂交(RDB)法进行CD41-42M,-28M,IVS-2-654M,CD71-72M等17种常见突变基因检测。结果当HbA;2≤2.5%,α地贫携带者检出率为90.73%(460/507);HbA;2>2.5%,α地贫携带者检出率为47.03%(830/1765),两组差别有统计意义(P<0.001),与对照组差别有统计意义。当HbA;2≥3.8%时,HPLC诊断β地贫的灵敏度和特异度最佳,常见突变型β地贫携带者的检出率为99.08%(536/541);当HbF≥2.3%时,常见突变型β地贫携带者的检出率仅为4.00%(1/25);当HbA;2≥3.8%结合HbF≥2.3%时,检出率98.78%(163/165),三组间比较差别有统计意义(P<0.001)。结论 HPLC是诊断β地贫的有效方法。HbA;2≥3.8%且HbF≥2.3%为HPLC诊断β地贫的最佳阈值,HPLC诊断β地贫敏感度与特异度的综合评价性能最理想。     

HPLC法测定大鼠脑组织磷酸二酯酶活性

目的建立大鼠脑组织磷酸二酯酶(PDE)活性测定的HPLC法。方法大鼠脑组织匀浆后,可溶部分为酶样品,以cAMP和cGMP为反应底物,采用双管法测定。色谱柱为Nova-PakC18(3.9mm×150mm,4μm);流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液(10∶90,V/V);流速为0.8mL·min~(-1);检测波长254nm。结果PDE底物(cAMP、cGMP)和系列产物(5’AMP、5’GMP、腺苷、次黄嘌呤和腺嘌呤)分离良好,无干扰。cAMP和cGMP检测限分别为0.125μmoL·L~(-1)和0.0625μmoL·L~(-1);平均回收率91.2%~102.8%;日内及日间RSD均<10%。大鼠脑组织PDE活性为(364.6601±66.6862)nmol·g~(-1)·min~(-1)(n=6)。结论本法能准确测定大鼠脑组织的PDE活性,方法简便、灵敏。     

转基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠后成肌调节因子的表达研究

目的 探讨携带micro-dystrophin基因的自体骨髓间充质干细胞移植mdx鼠后在移植鼠体内分化为肌细胞的可能机制.方法 采用逆转录病毒介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs(mMSCs),通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠.在移植后免疫荧光检测micro-dystrophin的表达并在不同时间点检测MyoD的表达.结果 移植后成功检测到micro-dystrophin,其表达随着移植时间的延长而增加;随移植时间延长MyoD阳性肌纤维比例增加,分别达到9%(4周时)、15%(8周时)、28%(12周时).RT-PCR和Western blot也发现,随着移植时间的延长,MyoD表达增加.结论 自体mMSCs可携带外源性micro-dystrophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞,移植入的干细胞向肌细胞的分化是一个持久的、连续的过程,成肌调节因子在调节其分化过程中发挥了重大作用.