人类P100蛋白表达抑制稳定株的建立及其对HeLa细胞周期的影响

目的构建针对人类P100(hP100)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒,转染后筛选P100表达抑制的稳定细胞株并鉴定其表达情况;同时检测其对细胞周期的影响。方法设计针对hP100基因的siRNA序列,构建pGenesil-shRNA-hP100质粒(smallhairpinRNA,shRNA,小发夹RNA),经测序鉴定后转染入宫颈癌细胞HeLa;经G418筛选出稳定株;Western印迹检测稳定株之抑制率。流式细胞术检测hP100蛋白表达抑制对细胞周期的影响。结果成功构建了针对hP100的siRNA质粒,并用之筛选出hP100蛋白表达抑制的稳定株,瞬时转染及稳定株hP100表达明显降低。流式细胞术显示抑制hP100蛋白表达使G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例降低。结论RNAi(RNA interference,RNA干扰)可持续稳定地抑制人类P100蛋白的表达,人类P100蛋白表达抑制对细胞周期有调节作用。     

IL-6、IL-8上调卵巢癌细胞雄激素受体表达的作用分别依赖MAPK途径和Src活化

目的 探讨IL-6、IL-8促进卵巢癌细胞增殖的分子机制.方法 在以往工作的基础上,选择兼有IL-6、IL-8受体及雄激素受体(androgen receptor,AR)表达的卵巢癌细胞系SKOV-3和OVCAR-3作为研究模型,观察AR阻断剂氟他胺(flutamide,Flu)对IL-6、IL-8诱导的促卵巢癌细胞增殖作用的影响,在此基础上进一步探讨两种细胞因子对AR表达的调节作用及相关信号传导通路.结果 ①AR阻断剂Flu不能阻断反而增强IL-6、IL-8诱导的促卵巢癌细胞增殖效应.②在无雄激素的条件下,IL-6、IL-8不仅能增加AR表达而且还能活化AR基因启动子,后者可被Flu完全阻断.③IL-6诱导的AR水平增加可被p38 MAPK、MEK1/2及ErbB2 MAPK阻断剂阻断,而IL-8诱导的AR水平增加则可被Src阻断剂阻断.结论 IL-6、IL-8很可能通过提高AR水平和AR活性从而增强卵巢癌细胞对雄激素的敏感性,由此通过产生的放大信号通路促进卵巢癌的生长和发展.IL-6、IL-8的上述活性分别依赖MAPK途径和Src活化.     

重组pEGFP-C2-FOXC1-C真核表达质粒的构建与表达

目的:将人FOXC1-C基因定向连入pEGFP-C2质粒,使FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究FOXC1-C蛋白的功能及定位奠定实验基础。方法:采用EcoR I和NotI双酶切方法,从pcDNA3.1(+)-FOXC1-C质粒中获得FOXC1-C蛋白的cDNA羧基末端;连入pEGFP-C2质粒的C端。将构建成功的pEGFP-C2-FOXC1-C质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见FOXC1-C片段;(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)FOXC1-C cDNA羧基末端成功连入pEGFP-C2质粒(;2)FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

干扰素基因刺激蛋白抑制剂改善视网膜血管内皮细胞白细胞粘附及糖酵解水平

目的观察氧化应激条件下干扰素基因刺激蛋白(STING)抑制剂对人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)的影响。方法实验研究。体内动物实验:将雄性健康C57BL/6J小鼠48只随机分为野生型小鼠组(WT组)、糖尿病(DM)组, 每组各24只。DM组小鼠经链脲佐菌素诱导建立DM模型。建模成功后, DM组再分为DM+二甲基亚砜(DMSO)组、DM+C176组, 每组各12只小鼠。DM+DMSO组小鼠按50 mg/kg的剂量腹腔注射DMSO;DM+C176组小鼠按50 mg/kg的剂量腹腔注射STING抑制剂C176共750 nmol。建模后4周, 采用免疫组织化学染色、蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测WT组、DM组小鼠视网膜STING表达情况;白细胞粘附实验检测WT组、DM+DMSO组、DM+C176组小鼠体内白细胞粘附于hRMEC数量。体外细胞实验:将hRMEC随机分为常规培养细胞组(N组)、DMSO组(加入DMSO干预)、C176组(加入C176干预)。各组加入150 μg/ml糖基化终末产物诱导细胞, 体外白细胞粘附实验联合4’’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色检测白细胞粘附于...     

慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00%、(35.71±2.81)%、(36.57±4.53)%、(15.33±4.75)%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。     

Kruppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究

背景 研究表明,Kruppel样因子6（KLF6）与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关.在眼科领域,关于人晶状体上皮细胞（LECs）中KLF6蛋白表达水平及KLF6对LECs增生的影响报道较少. 目的 探讨KLF6对LECs株（HLE-B3）增生的抑制作用. 方法 首先用逆转录PCR（RT-PCR）法构建真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6,并用双酶切法和PCR法对表达质粒进行鉴定.用含体积分数10％胎牛血清的低糖DMEM对HLE-B3进行培养和传代,按照干预方法的不同将培养的HLE-B3分成4个组,各组均给予KLE-B3转染试剂,空白对照组不加入任何外源质粒及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）;单纯IGF-1刺激组仅给予IGF-1刺激;空质粒转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2质粒空载体,同时给予IGF-1刺激;pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒,且给予IGF-1刺激.细胞干预24 h后,采用水溶性四唑盐-1（WST-1）实验检测各组细胞的吸光度（A450）值;采用Western blot法测定各组细胞中KLF6蛋白的表达水平.以1＆#215;104个/片的密度将HLE-B3细胞爬片培养24 h,并分别将0、0.10、0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染到各组铺片细胞中,用终质量浓度为50 μg/L的IGF-1刺激24 h,然后应用免疫细胞化学技术检测各组细胞中Ki-67蛋白的相对表达量;采用荧光半定量PCR法检测各组细胞中Ki-67 mRNA的表达变化.结果 扩增得到的PCR产物反应条带与KLF-6基因长度相符,PCR和EcoR I、Sal I限制性内切酶双酶切法鉴定条带大小与预期相符,成功构建pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒.WST-1实验显示空白对照组、单纯IGF-1刺激组、空质粒转染＋IGF-1组和pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞A值分别为0.86±0.00、2.10±0.01、2.24±0.12和1.06±0.02,4个组间差异有统计学意义（F=38.322,P＜0.05）,其中pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组A值明显低于单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组,差异均有统计学意义（q=6.42、7.31,P＜0.05）.Western blot法检测显示,4个组间细胞中KLF6蛋白相对表达量的差异有统计学意义（F=591.858,P＜0.05）,pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组KLF6蛋白相对表达量分别是空白对照组、单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组的1.47、2.04、3.27倍.Ki-67蛋白在pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞中的表达强度随质粒转染剂量的增加而逐渐减弱,0.10 μg和0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染后细胞中Ki-67 mRNA相对表达值分别为0.15±0.08和0.11±0.03,明显低于0μg pEGFP-C2-KLF6转染的细胞0.77±0.12,组间的总体差异有统计学意义（F=54.825,P＜0.05）. 结论 KLF-6能够抑制IGF-1诱导的HLE-B3的增生,是HLE-B3细胞增生的调控因子.     

糖尿病性白内障晶状体上皮细胞焦亡研究

目的:探究晶状体上皮细胞焦亡在糖尿病性白内障发生中的可能作用。方法:实验研究。选择2020年3至11月就诊于天津医科大学眼科医院行白内障摘除手术的70例（70只眼）患者,收集手术中房水及晶状体前囊膜。根据是否伴有2型糖尿病,分为糖尿病组和非糖尿病组,每组35例（35只眼）。采用Western印迹分析、实时定量PCR和免...     

新型转录共激活因子人类p100蛋白的抗体制备

目的：制备抗p100蛋白的特异性抗体。方法：利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白的方法纯化人类p100蛋白Tudor片段作为抗原，经免疫动物获得多克隆抗血清，并利用Western blot的方法检测抗体的特异性。结果：获得的抗p100蛋白抗体。经体内和体外试验验证的确可与其相应抗原特异性结合。结论：制备的抗p100蛋白的抗体通过与其抗原即人类p100蛋白在体内和体外试验中的特异性结合．为进一步探讨生理条件下p100蛋白在细胞内信号传导通路的作用提供了可靠工具。     

糖尿病小鼠视网膜p21活化激酶4表达上调及其对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响

目的观察p21活化激酶4(PAK4)对视网膜血管内皮细胞行为和线粒体功能的影响。方法实验研究, 分为体内动物实验和体外细胞实验两部分。体内动物实验:健康C57BL/6J雄性小鼠12只, 随机分为正常对照组、糖尿病组, 每组各6只小鼠。糖尿病组小鼠经链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型。建模后8周, 采用蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜PAK4表达情况。体外细胞实验:人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)分为常规培养细胞组(N组)、空载体组(Vector组)、PAK4过表达组(PAK4组)。各组加入150 μg/ml糖基化终末产物诱导细胞。细胞划痕实验检测各组hRMEC内细胞迁移情况;流式细胞仪检测各组白细胞粘附于hRMEC数量。Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定细胞内线粒体基础呼吸、三磷酸腺苷(ATP)生成、最大呼吸与备用呼吸能力。两组间比较采用t检验;三组间比较采用单因素方差分析。结果体内动物实验:与正常对照组小鼠比较, 糖尿病组小鼠视网膜中PAK4 mRNA、蛋白相对表达量显著升高, 差异均有统计学意义(t=25.372、22.41...     

增生型糖尿病视网膜病变患者外周血差异基因转录组学与基因表达总库的联合分析与验证研究

目的:筛选增生型糖尿病视网膜病变（DR）患者差异表达基因（DEG ）,为增生型DR(PDR）治疗提供新的生物学治疗靶点。方法:基础研究。2020年10月于天津医科大学眼科医院检查确诊的PDR患者3例（PDR组）及非糖尿病患者3例（对照组）纳入研究。另外分别选取同期PDR、非糖尿病患者各40例并据此分为PDR验证组、对照...