急性等容量血液稀释对大鼠全脑缺血再灌注时海马组织细胞凋亡的影响

目的 探讨急性等容量血液稀释(ANH)对大鼠脑缺血再灌注时海马组织细胞凋亡的影响.方法 健康清洁级雄性SD大鼠36只,体重280 ～ 320 g,50～60 d龄,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=12),假手术组(S组)仅游离暴露双侧椎动脉及颈总动脉;脑缺血再灌注组(I/R组)和ANH组采用四血管阻断法制备全脑缺血再灌注损伤模型.ANH组于灼烧双侧椎动脉后24h实施ANH,经股动脉放血(经10 min),放血的同时股静脉输注6％羟乙基淀粉130/0.4氯化钠,ANH结束后10 min时夹闭双侧颈总动脉5 min.于再灌注24 h时,处死大鼠,取脑组织,分离海马,采用流式细胞术测定细胞凋亡情况,采用反转录聚合酶链反应法测定Apaf-1 mRNA及caspase-3 mRNA的表达.结果 与S组比较,I/R组和ANH组海马组织细胞凋亡率升高,海马组织Apaf-1 mRNA及caspase-3mRNA表达上调(P＜0.01);与I/R组比较,ANH组海马组织细胞凋亡率降低,海马组织Apaf-1 mRNA及caspase-3 mRNA表达下调(P＜0.01).结论 ANH可抑制大鼠全脑缺血再灌注时海马神经细胞凋亡,其机制与下调Apaf-1及caspase-3表达有关.     

人前脑啡肽基因修饰人胚胎肾细胞的构建

目的 构建人前脑啡肽基因(hPPE)修饰的人胚胎肾细胞(HEK293细胞).方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/hPPE经限制性内切酶HindⅢ和Not Ⅰ进行双酶切获得hPPE基因,运用基因重组技术将hPPE基因与表达载体同源重组,转染293T细胞进行慢病毒包装、扩增、纯化,测定病毒滴度,再将重组的慢病毒载体转染HEK293细胞.用Western blot法检测hPPE基因在HEK293细胞中的表达.结果 重组慢病毒载体阳性克隆测序结果和基因库的hPPE基因序列完全一致.含有hPPE基因的慢病毒载体,滴度为2.07×108TU/ml.转染慢病毒载体后的HEK293细胞,在荧光显微镜下未见到GFP荧光.转染Ubc-GFP-L.V.空病毒载体的HEK293细胞,可见到较强的荧光.Western blot法检测到经慢病毒载体转染后的HEK293细胞中hPPE基因表达呈阳性.结论 成功构建了hPPE基因修饰的HEK293细胞,使hPPE基因可在HEK293细胞中稳定表达.     

miR-130b和RUNX3mRNA在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的 研究miR-130b和RUNX3mRNA在胃癌组织中的表达,并评价miR-130b对抑癌基因RUNX3表达的影响.方法 用荧光定量PCR技术检测40对胃癌组织及其对应的癌旁正常胃黏膜组织中miR-130b和RUNX3mRNA的表达量;用免疫组织化学SP法检测RUNX3蛋白的表达.结果 胃癌组织中miR-130b的表达显著高于对应的癌旁组织(2.18±3.75)比(2.59±3.45),P＜0.05;而胃癌组织中RUNX3mRNA的表达显著低于对应的癌旁组织(8.76±2.82)比(7.58±2.87),P ＜0.05.miR-130b和RUNX3mRNA的表达与胃癌的淋巴结转移、临床分期有关(P＜0.05),而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、远处转移、有无浸润周边器官组织无关(均P ＞0.05).miR-130b的表达与RUNX3蛋白的核表达、细胞核+细胞质的表达存在负相关(P＜0.05),而与RUNX3mRNA、RUNX3蛋白的细胞质表达无相关性(P＞0.05).结论 miR-130b和RUNX3mRNA的异常表达与胃癌预后有关;miR-130b可能通过减少RUNX3蛋白的表达水平导致肿瘤的发生.     

RNA干扰降低环氧化酶2基因表达对人胆管癌QBC939细胞的体外作用

目的研究小干扰RNA（siRNA）降低环氧化酶2（COX-2）基因对胆管癌QBC939细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白表达的影响。方法采用RNA干扰的方法,将胆管癌细胞株QBC939细胞分为4组：COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体、空白对照组。将COX-2 siRNA转染入QBC939细胞;流式细胞仪检测siRNA降低COX-2基因表达对凋亡的作用,WesternBlot法检测siRNA降低COX-2基因表达对caspase-3表达变化的影响。结果 RNA干扰后QBC939细胞COX-2表达下降至空白对照组的42%,流式细胞仪检测结果显示COX-2 siRNA干预组细胞的凋亡率以及凋亡蛋白caspase-3的表达明显高于其他3个对照组。结论 RNA干扰可抑制细胞COX-2蛋白的表达,促使胆管癌QBC939细胞的凋亡,caspase-3途径可能是其调控通路之     

微小RNA-494通过抑制Survivin诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的 观察微小RNA( miRNA) -494对人前列癌PC-3细胞中Survivin基因的表达抑制及对PC-3细胞增殖与凋亡的影响.方法 TargetScan 5.2预测miRNA-494与Survivin mRNA配对评分为mirSVR score:-0.4916、PhastCons score:0.4876;定量聚合酶链反应(qPCR)分析PC-3相对于正常前列腺上皮细胞株RWPE-1中miRNA-494的上下调情况;构建过表达miRNA-494的腺病毒载体,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪分析分别检测感染前后Survivin基因及蛋白的表达差异、细胞增殖及生长周期和凋亡变化.结果 miRNA-494在PC-3中的表达为RWPE-1中的(0.547±0.032)倍;Ad-pre-miRNA-494构建成功;实验组细胞增殖抑制呈现时间依赖性;和对照组比较,72 h后实验组Survivin蛋白表达为(21.69±4.62)％,与空载体组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),流式细胞仪检测结果显示实验组PC-3细胞G2/M期阻滞率及细胞凋亡率显著增加.结论 miRNA-494通过抑制前列腺癌PC-3细胞中Survivin基因的表达而诱导前列腺癌PC-3凋亡.     

氨甲环酸对体外循环冠状动脉旁路移植术患者的血液保护作用

目的 评价氨甲环酸对体外循环冠状动脉旁路移植术患者的血液保护作用.方法 本研究为前瞻性、随机、双肓、对照、临床研究,择期行体外循环冠状动脉旁路移植术患者200例,年龄18～64岁,体重50～ 100 kg,ASA分级Ⅰ～Ⅳ级.采用随机双盲法,将患者随机分为2组(n=100):对照组(C组)和氨甲环酸组(T组).麻醉诱导后T组静脉输注氨甲环酸负荷量10 mg/kg(输注时间20min),然后以10 rg·kg-1·h-1的速率静脉输注至术毕;C组给予等容量生理盐水.记录术后总引流量、术后大出血及二次开胸止血情况.记录围术期异体血使用情况、围术期并发症发生情况.结果 与C组比较,T组术后总引流量、大出血发生率、二次开胸止血率降低(P＜0.05),异体浓缩红细胞、血小板和新鲜冰冻血浆输入量和使用率均降低(P＜0.05).两组并发症发生率比较差异无统计学意义(P＜0.05).结论 氨甲环酸对体外循环冠状动脉旁路移植术患者具有血液保护作用,可显著减少术后出血与异体输血.     

尿毒症患者桡动脉钙化与骨密度及血清骨代谢指标的关系

目的 观察尿毒症患者桡动脉钙化情况并分析其与骨密度及血清骨代谢指标改变的关系.方法 以67例尿毒症患者为对象,取内瘘手术切除的桡动脉段,von Kossa染色及透射电镜检测血管钙化情况;检测Scr、血钙、磷、甲状旁腺素(iPTH);测定腰椎、股骨颈骨密度(BMD);放射免疫法测定血清25羟维生素D3 (25OHD)、1,25羟维生素D3[1,25(OH) 2D];ELISA法测定成纤维生长因子(FGF) 23、骨特异性碱性磷酸酶(BAP)、骨钙素(BGP)与Ⅰ型胶原吡啶交联物(ICTP).以23例健康体检者为对照,仅接受血清及骨密度检查.结果 von Kossa染色见24例(35.8％)尿毒症患者桡动脉中膜明显钙沉积;电镜发现中膜平滑肌细胞由 收缩型向分泌型转化,胞内有较多含钙囊泡,基质胶原明显增加伴钙磷结晶附着,程度与钙化评分一致.与对照组比较,尿毒症患者血磷、iPTH、FGF23、BGP、ICTP显著增加(均P＜0.05),血钙、25OHD、1,25(OH)2D显著降低(均P＜0.01),腰椎、股骨颈BMD也显著降低(均P＜0.01).相关分析显示,桡动脉钙化与糖尿病、股骨颈及腰椎骨密度Z值、ICTP、FGF23相关(r=0.62、-0.43、-0.25、0.34、0.86,P=0.000、0.012、0.001、0.018、0.000),与iPTH无相关(r=-0.08,P=0.306).按iPTH水平分层后,低iPTH(＜150 ng/L)组、高iPTH(＞300 ng/L)组患者iPTH与钙化相关(r=-0.41、0.31,P=0.044、0.023).多元回归分析显示,股骨颈骨密度Z值、ICTP、FGF23是桡动脉钙化的独立危险因素(β=-0.221、0.181、0.260,P=0.021、0.024、0.036).结论 尿毒症桡动脉钙化与平滑肌细胞合成和分泌较多的含钙基质有关,骨密度降低、骨转化率异常、骨吸收增加、血清FGF23水平增加是其危险因素.     

Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

目的：建立1种Leber遗传性视神经病（LHON）相关的3种原发性线粒体突变11778G＞A、14484T＞C和3460G＞A的无创检测方法。方法：研究对象为在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例（WZ1481、WZ1478、WZ1435）基因检测确定为m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者。采集3例LHON患者和2例野生型健康对照的静脉血样及口腔黏膜细胞样本,然后分别用手工法和试剂盒法提取全基因组DNA,分析比较2种样本、2种方法提取的DNA的纯度及浓度有无差别。最后以携带m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者和野生型的口腔黏膜细胞和外周血提取的全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增分别包含以上3种突变的DNA片段,然后进行焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析PCR产物。结果：口腔黏膜细胞和血液提取的DNA浓度的差异无统计学意义（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液DNA的纯度,差异有统计学意义（P＜0.05）。口腔黏膜细胞提取的DNA产量与血液相似。DNA测序结果显示血液样本和口腔黏膜细胞样本具有很好的一致性,对照组均检测不到突变,而突变组可以检测到相应的突变。斑点杂交和Southern blot的结果也一致,对照组均为阳性而突变组均为阴性。结论：口腔黏膜细胞DNA可用于筛查和鉴定LHON的3个主要线粒体突变。本研究建立了一种方便、无创的方法来检测LHON相关的m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变。     

快速拔管超声评分与心脏术后患者多器官信息临床指标的相关性研究

  目的  探讨快速拔管超声评分(fast-track extubation ultrasound score,FTEUS)用于反映心脏术后患者多器官信息临床指标的价值。  方法  前瞻性纳入华西医院2019年2~9月,心脏大血管术后,准备拔管脱离呼吸机的患者。根据心脏术后患者特点,制定快速拔管超声评分方案(fast-track extubation ultrasound score protocol,FTE-USP),即在常规快速脱机标准的基础上,使用FTEUS对患者进行流程化、个体化的评估。由两位观察者分别使用FTE-USP进行患者超声影像评价,并用Kendall一致性系数判断观察者间一致性。评估FTEUS与各临床指标的相关性。  结果  共207例患者纳入研究,其中男性89例,女性118例,年龄为(54.63±11.80)岁,FTEUS均在床旁完成,完成时间为(8.23±2.08) min,观察者间Kendall一致性系数0.941。随FTEUS总分增加,临床不良事件发生率随之增加(特别是心律失常发生率增加),肝、肾、心、肺等器官功能指标有明显变化,其中血清肌酐水平、血清胱抑素C水平、血清N端脑钠肽前体水平、术后监护室时间、拔管后无创机械通气时间、心律失常发生率与FTEUS呈正相关(P < 0.05)。FTEUS达到5分时,心律失常(14/24,58.3%)、心肺复苏(2/24,8.3%)、脱机失败(2/24,8.3%)发生率均增加。  结论  FTE-USP整合了多器官信息,可于心脏术后患者床旁快速完成,并警示不良事件,有应用于协助临床决策的潜力。     

siRNA介导RRM2基因沉默治疗人卵巢癌裸鼠移植瘤

目的 探讨siRNA沉默核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)基因联合顺铂治疗人卵巢癌裸鼠移植瘤的可行性。 方法 常规体外培养人卵巢癌细胞株SKOV3,采用皮下注射法建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,将24只荷瘤鼠随机分为对照组、顺铂组、siRNA组、siRNA联合顺铂组,每组6只,分组给药。观察肿瘤生长情况,测瘤体积并计算肿瘤生长抑制率。采用RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测肿瘤组织中RRM2 mRNA及蛋白表达。 结果 对照组、siRNA组、顺铂组和siRNA联合顺铂组平均肿瘤体积分别为(358.28±46.40)、(261.38±52.49)、(261.65±31.97)、(189.37±41.67)mm³,单药作用后肿瘤体积差异有统计学意义(F_siRNA-RRM2=22.399,P_siRNA-RRM2<0.001;F_顺铂=22.254,P_顺铂<0.001);两药间无交互作用(F=0.474,P=0.499)。对照组、siRNA组、顺铂组和siRNA联合顺铂组肿瘤生长抑制率分别为0、36.39%、41.10%、64.33%。siRNA-RRM2与顺铂单药各自均能降低RRM2 mRNA表达水平(F_siRNA-RRM2=9.37,P_siRNA-RRM2=0.006;F顺铂=11.90,P顺铂=0.003)和蛋白表达水平(F_siRNA-RRM2=8.71,P_siRNA-RRM2=0.008;F顺铂=13.01,P顺铂=0.002);两药间无交互作用(F_{RRM2 mRNA}=3.93,P_{RRM2 mRNA}=0.061;F_RRM2蛋白=1.72,P_RRM2蛋白=0.204)。 结论 单用siRNA或联用顺铂均可有效抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤瘤体的生长,可能与其沉默RRM2基因表达有关,特异性沉默RRM2或可成为卵巢癌治疗的一个新思路。