小鼠肠癌HSP70多肽复合物的纯化及其抗肿瘤免疫效应

目的:应用AKTA-purifier100液相层析系统,建立分离和纯化热休克蛋白70(HSP70)多肽复合物的方法,并观察其抗肿瘤免疫保护效应。方法:采用DE-AE-Sepharose离子交换层析和ADP-Ag-arose亲和层析,从热处理的BALB/c鼠源性结肠癌细胞(CT26)制备裂解液中分离、纯化HSP70多肽复合物,并通过主动免疫保护实验观察其抗肿瘤免疫效应。结果:纯化蛋白经鉴定为相对分子质量70×103左右的HSP70多肽复合物;平均1g湿重肿瘤细胞可获得63.63μgHSP70多肽复合物;HSP70主动免疫的小鼠可抵抗CT26细胞的攻击。结论:用此层析法可分离纯度较高的HSP70,并可诱导明显的抗肿瘤免疫保护效应。     

CIK与DC细胞联合治疗145例晚期恶性实体瘤

目的 研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和树突状细胞(DC)联合治疗晚期肿瘤. 方法 从外周血分离单个核细胞,体外经GM-CSF和白细胞介素4(IL-4)诱导产生DC细胞,淋巴细胞经干扰素γ(IFN-γ)、IL-2、CD3单抗和IL-1α体外诱导产生CIK细胞,采用流式细胞术检测CIK的表型,并回输患者进行治疗,至少接受3次治疗. 结果 82例可评价病灶的患者中,3例完全缓解(CR),7例部分缓解(PR);31例不可评价病灶的患者中,7例患者胸腹水消失,与治疗前相比,治疗后患者CD3 和 CD8 明显升高(P＜0.05). 结论 CIK细胞治疗晚期恶性实体瘤有一定的临床疗效,为该类患者的治疗提供一种有效的免疫治疗手段.     

突触核蛋白在结直肠癌中的表达模式及其临床意义

目的 探讨结直肠癌组织中突触核蛋白（Synuclein）的表达模式,并分析其与临床病理特征的关系。方法 半定量RT-PCR检测20例结直肠癌及其癌旁组织中α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein基因的mRNA水平,免疫组化SP法检测51例结直肠癌及其癌旁组织中α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein蛋白的表达。结果 结直肠癌组织中α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein mRNA的的相对表达量分别为0.62±0.32、0.61±0.32和0.72±0.37,显著高于癌旁组织的0.41±0.27、0.40±0.25和0.45±0.25（P=0.034,P=0.026,P=0.007）。γ-synuclein蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率为47.1％,显著高于癌旁组织的23.5％（P=0.022）,而α-synuclein、β-synuclein蛋白在结直肠癌和癌旁组织中的表达差异无统计学意义。在α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein表达模式的8种组合中,任一种蛋白表达、α-synuclein或γ-synuclein、β-synuclein或γ-synuclein、α-synuclein和γ-synuclein在结直肠癌组织中的表达率明显高于癌旁组织（P＜0.05）。α-synuclein、β-synuclein蛋白的表达与临床病理特征无关,γ-synuclein蛋白的表达与分期和淋巴结转移有关（P=0.047,P=0.048）。淋巴结转移及分期较晚者任一蛋白的阳性表达率明显高于无淋巴结转移及分期较早者（P=0.030,P=0.040）。结论 Synuclein在结直肠癌组织中的表达较癌旁组织有增高的趋势,其中γ-synuclein对于评估结直肠癌病程的发展和转归具有潜在价值。     

快速蛋白液相色谱系统分离与纯化小鼠结肠癌细胞热休克蛋白70

目的:应用快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)系统,建立分离和纯化BALB/c鼠源性结肠癌细胞(CT26)热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的方法。方法:用经43℃热处理12h的CT26细胞制备裂解液,经DEAE-Sepha-rose离子交换层析柱和ADP-Agarose亲和层析柱进行连续分离,所得蛋白经不连续SDS-聚丙烯酰胺电泳及Western-blotting进行蛋白相对分子质量及性质鉴定。结果:纯化蛋白经鉴定为相对分子质量70×103的HSP70。结论:通过FPLC系统可分离纯度较高的HSP70。     

流式细胞术检测乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞的意义

目的探讨EpCAM、CK18和CD45的表达在判断乳腺癌患者外周血微转移的意义。方法应用Moflo XDP超高速流式细胞仪对于62例女性乳腺癌及20例女性健康志愿者外周血EpCAM、CK18和CD45的表达情况进行研究,以循环肿瘤细胞(CTCs)数目≥5个/7.5mL外周血定义为微转移阳性。结果本法检测CTCs的敏感性为10-6。20例健康志愿者CTCs均为阴性,乳腺癌患者阳性率53.2%(P<0.001);乳腺癌患者I～IV期CTCs阳性率比较的差异有统计学意义(P=0.002)。结论利用Moflo XDP超高速流式细胞仪检测乳腺癌CTCs可行,可重复性高。患者CTCs状态与临床分期相关联。     

人热休克蛋白对树突状细胞表面共刺激分子表达影响的研究

目的:研究人热休克肿瘤抗原复合物对树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子表达的影响。方法:分离培养人外周血来源的DC细胞,在培养过程中加入分离纯化的人热休克蛋白70(HSP70)抗原复合物及肿瘤细胞裂解物,流式细胞技术分析比较负载HSP70肿瘤抗原复合物、负载肿瘤细胞裂解物及负载前DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86及HLA-DR表达水平的变化。结果:培养基中加入HSP70肿瘤抗原复合物后,其表面共刺激分子CD80、CD86和成熟标记分子CD83的表达水平分别为(98.9±1.5)%、(98.3±1.3)%和(53.1±0.8)%,与负载前CD80、CD86和CD83的(66.2±1.6)%、(94.2±2.0)%和(16.3±1.4)%相比显著提高,P=0.013;与肿瘤细胞裂解物负载的DC表面CD80、CD86和CD83的(86.2±1.9)%、(96.5±1.1)%和(55.1±1.0)%相比,共刺激分子CD80的表达显著提高,P=0.020。结论:人热休克肿瘤抗原复合物可提高DC表面共刺激分子的表达水平,促进DC功能活化,有可能在抗肿瘤免疫机制中起重要作用。     

胃癌细胞系亚克隆的分离及生物学特性研究

肿瘤组织中存在着不同的肿瘤细胞亚群。其中含有肿瘤干细胞。本实验通过有限稀释法。证明了人胃癌细胞系BGC-823存在亚克隆细胞。并对亚克隆与母株之间进行形态学、细胞增殖、克隆形成及成瘤性进行比较分析。     

抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究

[目的]探讨抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导CIK（cytokine induced killer）的杀伤作用。[方法]联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4（IL-4）从外周血单个核细胞中培养DC，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC，流式细胞仪检测致敏前后DC表型的变化，用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC诱导CIK，用MTT法检测淋巴细胞的增殖及原致敏DC诱导CIK对SGC的杀伤效应。[结果]①利用GM-CSF及IL-4可从外周血单个核细胞中获取DC，肿瘤抗原可促进DC的成熟，肿瘤抗原致敏可促进DC成熟，细胞表面分子HLA-DR、CD86、CD86升高，CD14下降。②混合淋巴细胞反应提示成熟的DC可促进CIK细胞增殖。③SGC肿瘤抗原致敏DC诱导CIK对胃癌细胞SGC有特异性的杀伤作用，随着效靶比的升高，杀伤效应随之增强。[结论]抗原致敏的DC可通过诱导特异性CIK细胞及促进CIK细胞增殖两方面显著提高CIK细胞的杀瘤效应。     

原发性胃癌p16INK4a基因缺失和突变的研究

目的探讨p16INK4a基因缺失和突变在胃癌发病机制中所起的作用。方法采用多重PCR、PCR-SSCP和DNA测序对62例胃癌、癌旁组织及10例正常胃黏膜标本中p16INK4a基因纯合性缺失和突变进行检测。结果62例胃癌中发现p16INK4a基因第一外显子和第三外显子各有2例纯合性缺失,缺失率6.5%(4/62),PCR-SS-CP和DNA测序发现1例p16INK4a基因第一内含子区碱基插入,突变率1.6%(1/62),癌旁和正常胃黏膜均未发现缺失和突变。结论在原发性胃癌中,p16INK4a基因纯合性缺失率很低、突变罕见。     

树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究

目的:研究人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞的影响,以期获得具有抗原特异性杀伤功能的细胞毒活性细胞,并分别对CIK、LAK和CD3AK的杀伤效果进行比较。方法:采用某一肺腺癌肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC),经体外诱导分别扩增出CIK、LAK、CD3AK和DC细胞,再将靶细胞抗原孵育过的DC同三种细胞共同培养,通过镜下动态观察CIK联合DC对癌性胸腔积液中肿瘤细胞的杀伤活性,并利用MTT法检测CIK联合DC体外杀伤人肺腺癌细胞系(SPC-A1)的活性,同时比较CIK、LAK和CD3AK三种细胞的体外杀瘤活性。结果:CIK-A-DC的杀伤活性最强为92.3%,明显高于单纯CIK的59.7%和DC-CIK的79.8%,(P值分别为0.025和0.042),提示CIK-A-DC细胞对肿瘤杀伤的特异性。而DC-CIK的杀伤活性为79.8%,也高于单纯CIK对照组59.7%,P=0.034,说明DC具有明显增强CIK细胞杀瘤活性的功能。同时,不论从单纯CIK、LAK、CD3AK细胞毒活性,或是从三种细胞联合DC的细胞毒活性比较,CIK细胞较后两种细胞都具有更强的杀伤活性,P值分别为0.038和0.022。联合DC的自体CIK细胞体外杀瘤活性显著增强,CIK细胞的杀伤活性显著高于LAK、CD3AK两种细胞。结论:DC可明显提高自体CIK细胞的体外杀瘤活性。