碱基错配对短发夹RNA逆转白血病细胞耐药作用的影响

目的探讨碱基错配对短发夹RNA（shRNA）逆转白血病细胞耐药作用的影响。方法针对mdrl基因mRNA合成一条序列正确的shRNA及正义链少1个碱基的对应错配shRNA，构建一对抗mdrlshRNA真核表达载体，脂质体介导转染白血病耐药细胞株K562／A02。采用实时荧光定量RT．PCR检测mdrlmRNA表达；柔红霉素泵出实验检测P．gp外排泵功能；M1rr法检测细胞对阿霉素的敏感性。结果序列正确和对应错配shRNA真核表达载体均明显下调mdrlmRNA的表达，降低细胞膜P-gP外泵功能，60min柔红霉素泵出率分别为6％和10％，显著低于对照组的45％；细胞内柔红霉素平均荧光强度分别为9．51和7．09，明显高于对照组的2．80；对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为90％和87％。结论正义链碱基错配shRNA对RNA干扰功能无明显影响，与序列正确的shRNA一样可有效逆转mdrl所致的耐药。     

硼替佐米联合柔红霉素对成人急性白血病原代细胞生长、凋亡的影响

目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米单药以及联合柔红霉素对成人急性白血病原代细胞生长、凋亡和Bcl-2 mRNA表达的影响.方法 用Ficoll液分离各型成人急性白血病患者骨髓单个核细胞,分别加入不同浓度硼替佐米(5、10、20、50 nmol/L)、柔红霉素(50、100、200、500 nmol/L),以及低浓度硼替佐米(5、10 nmol/L)联合不同浓度柔红霉素(50、100、200、500 nmol/L)进行细胞培养;采用MTT方法检测培养48 h后细胞增殖活性,计算抑制率、半抑制浓度(IC50)和相互作用系数(CDI).流式细胞术检测培养24 h后细胞凋亡率,RT-PCR检测培养48h后凋亡基因Bcl-2 mRNA表达.结果 所测各型急性白血病细胞生长抑制率随硼替佐米或柔红霉素单药浓度增高而增高;柔红霉素联合小浓度硼替佐米(5、10 nmol/L)后,柔红霉素的IC50由(102±27)nmol/L分别减小为(73±26)、(55±22)nmol/L;柔红霉素200 nmol/L联合硼替佐米10 nmol/L时协同作用最为显著,CDI=0.17.柔红霉素100 nmol/L联合硼替佐米20 nmol/L组与未加药组或单药组比较细胞凋亡率增高、Bcl-2 mRNA表达下降(P<0.05).结论 硼替佐米联合柔红霉素对成人急性白血病原代细胞有协同促凋亡和抑制白血病细胞生长的作用,有一定的临床应用前景.     

冬凌草甲素抗T细胞急性淋巴细胞白血病效应的实验研究

目的 探讨冬凌草甲素对T细胞急性淋巴细胞白血病的抗白血病效应及其机制。方法 以T细胞急性淋巴细胞白血病细胞株CEM为研究对象,应用改良MTT法测定不同浓度及不同时间冬凌草甲素对CEM细胞增殖和生存率的影响,计算72 h的半数抑制浓度（IC50）;显微镜下观察5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素处理24 h后CEM细胞的形态学变化;流式细胞术检测0.5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后CEM细胞的凋亡百分率;应用Western blot法检测7.5 μmol/L冬凌草甲素作用后细胞mTOR、P70、4EBP1、RAF、ERK、STAT5信号蛋白水平,以及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化。结果 ①冬凌草甲素呈浓度及时间依赖性抑制CEM细胞增殖,作用72 h的IC50值为（7.37±1.99）μmol/L ;② 5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后CEM细胞边界不清晰,部分细胞崩解,且浓度越高,细胞形态改变越明显;③ 0、5、7.5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后,细胞凋亡百分率分别为（4.8±2.11）%、（19.03±2.54）%、（40.27±3.31）%;（57.23±6.69）%;④冬凌草甲素明显抑制CEM细胞mTOR、P70、4EBP1、RAF、ERK、STAT5信号蛋白的活化;下调CEM细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达。结论 冬凌草甲素可能通过抑制mTOR/P70(4EBP1)、RAF/ERK、STAT5信号蛋白的活化,以及上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2而发挥抗白血病作用。     

mTORC1/2抑制剂与伊马替尼联用抑制Ph +ALL细胞株生长的作用机制

【摘要】 目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C1/2（mTORC1/2）抑制剂PP242与伊马替尼（IM）联用对费城染色体阳性（Ph+）急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞株SUP-B15的抗白血病作用及机理。方法 以SUP-B15细胞为研究模型,MTT法检测IM与PP242联合处理SUP-B15细胞72 h后的半数抑制浓度（IC ₅₀ ）及联合作用指数（CI ）;Western blot法检测PP242处理SUP-B15细胞后对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR通路的影响,以及IM与PP242联合处理SUP-B15细胞后对PI3K/Akt/mTOR通路及凋亡相关蛋白的影响。结果 IM单用于SUP-B15细胞的IC ₅₀ 值为（1.50±0.09） μmol/L。而IM与20、30、50 nmol/L PP242联用于SUP-B15细胞,其IC ₅₀ 分别下降为（0.81±0.030） μmol/L、（0.36±0.140） μmol/L、（0.02±0.002） μmol/L, CI 值分别为0.764、0.545、0.507,提示两药有较高的协同作用。PP242单独作用于SUP-B15细胞后,磷酸化Akt（p-Akt）、p-4EBP1、p-elF4E、p-ABL、p-mTOR、p-P70等 PI3K/Akt/mTOR通路上的关键磷酸化蛋白表达下调,且这种变化呈现浓度和时间依赖性。PP242与IM联合用于SUP-B15细胞时,SUP-B15细胞PI3K/Akt/mTOR通路的各关键蛋白下调较PP242或IM单用时更明显,凋亡相关蛋白Bax、cleaved Caspase-3上调也较两药单用时更明显。结论 PP242与IM联合使用时可增强对于PI3K/Akt/mTOR通路的抑制,增加由Bax、Caspase-3所介导的凋亡作用。     

中国蕲蛇毒的碘化标记物制备及鉴定

用Ｉｏｄｏｇｅｎ法按￣（１２５）Ｉ标记ＣＡＡＶ，标记物比放射性为４２３６．５×１０￣（１０）Ｂｑ／ｍｍｏｌ，放化纯９８％，每个ＣＡＡＶ分子上带０．５２个￣（１２５）Ｉ原子，与非标记ＣＡＡＶ有相同的理化性质。￣（１２５）Ｉ－ＣＡＡＶ与血小板的结合具有饱和性，每个血小板上ＣＡＡＶ结合位点数为１３２５５±６２９２，Ｋｄ值为３．２±０．６９×１Ｏ￣（－１０），这与其它蛇毒在血小板上结合位点数类似。研究表明所标记的ＣＡＡＶ符合放射结合分析的要求。     

核酶对白血病耐药细胞株K562/A02耐药性逆转的研究

肿瘤耐药及其逆转是当今肿瘤治疗研究的热点。耐药的发生与多药耐药基因 (ｍｄｒ1)及其编码的Ｐ糖蛋白 (Ｐ ｇｐ)过度表达关系密切。我们采用电击基因导入法将特异切割ｍｄｒ1ｍＲＮＡ的锤头状核酶基因导入白血病耐药细胞株Ｋ5 6 2 Ａ0 2 ,研究该核酶抑制ｍｄｒ1基因及Ｐ ｇｐ表达 ,逆转肿瘤细胞耐药性的作用。材料和方法1　细胞株　Ｋ5 6 2细胞株系人红白血病细胞株[1 ] ,由上海血液学研究所提供。Ｋ5 6 2 Ａ0 2细胞株为阿霉素诱导Ｋ5 6 2细胞建立的多药耐药细胞株 ,由中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所提供。2　质粒　真核…     

冬凌草甲素抗Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病效应的实验研究

目的 探讨冬凌草甲素对Ph染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)的抗白血病效应及其机制.方法 以Ph+ALL细胞株SUP-B15为研究对象,应用改良MTT法测定冬凌草甲素对SUP-B15细胞增殖的影响,计算72 h的半数抑制浓度(IC50);光学显微镜下观察冬凌草甲素处理后SUP-B15细胞的形态学变化;用流式细胞术检测药物作用前后SUP-B15细胞的凋亡率;以K562细胞为对照,应用Western blot法比较药物作用前后SUP-B15细胞Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5信号转导通路活化水平,以及凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax的变化.结果 ①冬凌草甲素呈浓度及时间依赖地抑制SUP-B15细胞增殖,作用72 h的IC50值为(7.08±1.21)μmol/L;②冬凌草甲素处理24 h后光学显微镜下SUP-B15细胞边界不清晰,部分细胞崩解;③0、5、10 μmol/L冬凌草甲素作用24 h后,SUP-B15细胞凋亡百分率分别为(6.67±0.83)%、(18.30±1.79)%、(37.63±7.12)%;④冬凌草甲素明显抑制SUP-B15细胞ABL酪氨酸激酶及其下游Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5多条信号转导通路的活化;下调SUP-B15细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达.结论 冬凌草甲素通过抑制ABL酪氨酸激酶及其下游Akt/mTOR、Raf/MEK/ERK、STAT5信号转导,以及上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2而发挥抗Ph+ALL作用.     

SCL/TAL-1基因沉默对EPO诱导的K562细胞红系分化的影响

目的 通过RNA干扰技术降低SCL/TAL-1 mRNA的表达,探讨SCL/TAL-1在K562细胞红系分化中的作用.方法 以EPO诱导白血病细胞系K562细胞向红系分化为模型,将靶向SCL/TAL-1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)慢病毒质粒pTRIP-dU3- RNAiTALh-EF1a-GFP转染K562细胞,RT-PCR检测其SCL/TAL-1和红系相关基因RhD、血型糖蛋白A(GPA,即CD253a)、CD47 mRNA表达水平变化,流式细胞术分析红系分化抗原CD71、CD253a的表达,并以空载体质粒pTRIP-dU3- RNAiluc-EF1-GFP转染的K652细胞为对照.结果 ①通过慢病毒转染系统将含SCL/TAL-1 shRNA的质粒及空载体质粒转染K562细胞48 h,绿色荧光蛋白(GFP)+细胞占总细胞的95%以上,表明感染率达到95%以上.②RT-PCR结果显示转染特异性shRNA的K562细胞SCL/TAL-1 mRNA表达水平比空载体对照明显下调(P<0.05),红系抗原CD47和RhD mRNA水平也比对照组明显下调(P<0.05),GPA有所下降,但没有CD47和RhD下降程度大.③流式细胞术检测到SCL/TAL-1低表达组红系分化抗原CD71、CD235a表达降低,表达率分别是10.4%、76.5%,而在对照组的表达率分别为94.3%、83.6%.结论 研究结果提示转录因子SCL/ TAL-1参与了红系定向分化.