荧光共振能量转移法对细胞cAMP含量的实时检测

大鼠成纤维样滑膜细胞(FLS)转染pcDNA3-ICUE3质粒,用荧光共振能量转移(FRET)法观察前列腺素(PGE2)刺激下大鼠FLS环磷酸腺苷(cAMP)水平的实时变化,与放免法检测进行比较.FRET检测到FLS在PGE2刺激后1 min,cAMP升高14.93％,且不同批次实验差异较小;放免法检测到cAMP升高7.79％;FRET可检测到PGE2受体拮抗剂对cAMP产生的抑制,可观察到1 nmol/L PGE2促进cAMP产生,放免法检测PGE2产生效应最低浓度为0.1μmol/L.提示FRET法检测灵敏、重复性高,为G蛋白偶联受体信号通路研究的可靠技术手段.     

采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shR...     

应用SOD后实验性骨痂超微结构观察及体视学分析

为探讨超氧化物歧化酶（SOD）对实验性骨折愈合的影响，给实验性骨折大鼠静脉注射SOD，透射电镜观察实验性骨痂组织、细胞的超微结构改变，并用微机图像处理系统对骨痂骨系细胞进行立体定量分析。结果显示：SOD可使①早期骨痂内毛细血管含量增加；②骨生成细胞增殖并向成骨细胞转化，成骨细胞数量增加，体积较大；③成骨细胞、成纤维细胞和破骨细胞功能活跃，骨痂的骨化、改建以及塑建速率加快。结论：SOD可作为促进骨折愈合的辅助药物。