胸腺素α1-硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α     

胸腺素α1的生化特性及生物学活性的分析

目的 :建立确定胸腺素α1纯度、分子量和等电点等生化特性和生物学活性检测的方法。方法 :应用高效液相色谱、三羟甲基甘氨酸 -SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦 -聚丙烯酰胺凝胶电泳和3H -TdR掺入法 ,在致有丝分裂原存在的条件下 ,刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力。结果 :胸腺素α1的纯度为 98% ,其相对分子质量为 3 15 3 ,等电点为3 93,在 1 5 6～ 12 5 μg·mL-1剂量范围内脾淋巴细胞的增殖率明显提高。结论 :本文所用检测方法能准确地测定胸腺素α1的纯度、相对分子质量和等电点 ,有效地测定其生物学活性 ,适用于胸腺素α1的质量鉴定     

冻干小鼠神经生长因子的研制

目的　研制小鼠神经生长因子 ( NGF) .方法　采用二次阳离子柱层析法 ,从雄性小鼠颌下腺分离提取 2 .5 S神经生长因子 ,建立了稳定的实验室与中试生产工艺 ,以及相应的质量鉴定规程 .结果　从体质量超过 2 5 g,鼠龄大于 60 d的雄性小鼠体内可获得高纯度、高产量、高活性的 2 .5 SNGF.纯度大于 95 % ,与抗 2 .5 S NGF抗体有特异结合能力 ,鸡胚背根神经节培养法测定的生物活性显示 ,其比活性达到 5× 10 8BU· g- 1 ( BU:生物活性单位 )以上 ,各项指标均符合质量鉴定标准 . 2 0 g· L- 1 人血白蛋白做冻干赋形剂 ,能有效保护 NGF的生物活性 .结论　研制了高质量的冻干小鼠神经生长因子 ,为 NGF的临床前和临床研究奠定了基础 .     

改变部分TIR对EPO模拟肽8串联体表达的影响

目的　通过改变部分翻译起始区序列观察对 EPO模拟肽基因 8串联体表达的影响 .方法　设计和人工合成了部分翻译起始区域 (translation initiation region,TIR) DNA序列 ,将该序列插入 p BSEPOM8(含 EPO模拟肽基因 8串联体序列 )的 Eco RI和 X ba I位点 ,经 DNA测序确定正确重组质粒 ,再将 EPO模拟肽基因 8串联体 (含改建的翻译起始区域 )克隆到 p BV2 2 0载体的 Eco RI和 Bam HI位点 ,诱导表达 .结果　 DNA测序证明 ,人工合成的 DNA序列已正确插入EPO模拟肽基因 8串联体的翻译起始区域 .该串联体基因插入 p BV2 2 0载体后 ,经 42℃诱导 ,在细菌裂解上清中出现一条相对分子质量为 2 2× 10 3(Mr)的新蛋白带 ,与 EPO模拟肽基因 8串联体的理论计算分子量相符合 .经薄层扫描证明该蛋白带约占细菌蛋白总量的 15 % .结论　通过改变部分翻译起始区域起动了 EPO模拟肽基因 8串联体的翻译 ,使原来不表达的 EPO模拟肽基因 8串联体获得了较高水平的表达     

重组人B7-H1IgV疫苗对小鼠骨髓瘤细胞的抑制作用

目的:探讨重组人B7-H1IgV融合蛋白对小鼠骨髓瘤的预防和治疗效果及其对荷瘤小鼠外周血中CD4 CD25 T细胞水平的影响.方法:用重组人B7-H1IgV融合蛋白免疫小鼠,待抗体产生后接种SP2/0肿瘤细胞作为预防组;用重组人B7-H1IgV融合蛋白免疫小鼠,同时接种SP2/0肿瘤细胞作为治疗组.监测小鼠体质量、肿瘤体积的变化及生存期;检测小鼠体内CD4 CD25 T细胞水平.结果:重组人B7-H1IgV融合蛋白在预防组和治疗组中均显示出了较好的抑瘤作用,并可显著降低治疗组小鼠体内CD4 CD25 T细胞水平.结论:重组人B7-H1IgV融合蛋白能够引起小鼠的体液免疫,并抑制SP2/0肿瘤细胞的生长,从而延长荷瘤小鼠的生存期.rhB7-H1IgV融合蛋白肿瘤疫苗有望成为一种肿瘤免疫治疗的候选者.     

重组胸腺素α1的分离纯化和活性测定

目的：利用融合表达载体pThioHisA的重组质粒pThioHisA-Tα1④,转化大肠杆菌TOP10得到的工程菌,来分离纯化表达的胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1),方法将高效表达融合蛋白的工程菌用菌胞破碎器裂解,经80℃热处理,离心上清采用Q－SepharoseFF阴离子交换色色谱纯化Tα1单体,应用SDS－PAGE,2L－Tricine-SDS-PAGE和HPLC进行鉴定。结果SDS－PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白牛菌体总蛋白的400g.kg^-1,经2L－Tricine-SDS-PAGE分析证实,融合蛋白可裂解出Tα1单体,裂解物经简单的离子色谱可以纯化出Tα1单体,HPLC鉴定纯化的Tα1纯度可达950g.kg^-1以上,利用^3H-TdR进行的生物活性测定表明,在致有丝分裂原ConA存在的条件下,融合蛋白和Tα1单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的Tα1相比具有相似的生活性。结论该方法是分离纯化Tα1简便易行,经济有效的方法,同时也为Tα1的分离纯化和大规模的开发生产奠定了基础。     

人转铁蛋白受体结合肽的噬菌体肽库筛选与鉴定

目的：从噬菌体呈现12肽库中筛选与人转铁蛋白受体结合的肽．方法：以人转铁蛋白受体为靶蛋白，生物淘洗法从噬菌体呈现12肽库中筛选与之结合的阳性噬菌体，用噬菌体ELISA，FCM及免疫组化等方法检测阳性噬菌体与人转铁蛋白受体的结合活性．结果：从噬菌体肽库中筛选到-呈现SPRPRHTLRLSL肽的噬菌体，噬菌体ELISA，FCM及免疫组化等方法均证明呈现该肽的噬菌体可与人转铁蛋白受体或高表达人转铁蛋白受体的细胞结合．结论：SPRPRHTLRLSL具有与人转铁蛋白受体结合的活性，它为以转铁蛋白受体为靶点的导向性药物的开发提供了一个可能的线索．     

四君子汤对脾虚患者外周血单个核细胞白细胞介素—6mRNA表达 …

近来白细胞介素 6(ＩＬ 6)这一淋巴因子在免疫性疾病的发病中研究颇多 ,为了探讨ＩＬ 6ｍＲＮＡ在脾虚患者体内表达水平是否正常 ,检测了脾虚证患者血清中ＩＬ 6受体 (ｓＩＬ 6Ｒ)和ＩＬ 6的水平 ,并与健康人比较 ,现报告于下。资料和方法1　临床资料　脾虚组 18例 ,为本院中医科门诊与住院患者 ,男 10例 ,女 8例 ,年龄 39～ 62岁 ,平均( 50 5± 8 3)岁 ,其中慢性胃炎 6例 ,慢性肠炎 5例 ,混合性贫血 3例 ,特发性血小板减少 4例。具备有脾虚证辨证参考标准( 1) 中的每一项即纳差、乏力 ,食后或午后腹胀 ,便溏 ,消瘦 ,面色不华 ,舌淡苔白 ,…     

重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的: 构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1. 方法: 应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析. 结果: 成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1, 表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力. 结论: 成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.     

SiRNA对大鼠钙调神经磷酸酶活性及VSMCs增殖的影响

目的:观察神经肽Y(NPY)刺激的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中钙调神经磷酸酶(CaN)活性和c-fos表达水平的变化,以及RNA干扰抑制CaN活性的作用.方法:采用组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞;NPY刺激培养的大鼠VSMCs增殖;RNA干扰特异性抑制CaN的活性及其mRNA的表达,阻断NPY刺激的大鼠VSMCs中CaN依赖的信号转导通路,观察对CaN活性、细胞增殖、核内原癌基因c-fos表达水平的变化.结果:NPY可增加VSMCs的CaN活性,加快细胞增殖及增加核内c-fos表达水平.RNA干扰抑制CaN活性后,明显降低NPY刺激的VSMCs增殖及核内c-fos表达水平.结论:CaN参与了NPY刺激的VSMCs增殖,RNA干扰通过抑制CaN的活性可阻断NPY诱导的VSMCs增殖作用.