新型肿瘤坏死因子免疫抑制剂的克隆和表达

目的：用鸡卵清溶菌酶（hen egg-white lysozyme,HEL)T辅助细胞表位序列替换新型rhTNF—α3’末端序列，构建和表达新型rhTNF-α免疫抑制剂。方法：克隆、表达、纯化和鉴定新型rhTNF-α免疫抑制剂。结果：DNA测序表明，重组新型hTNF—αHEL的3’末端序列与设计序列完全相同。将其转移到pBV220表达载体中，重组菌经42℃诱导后做SDS—PACE分析，结果显示该重组体获得了表达，其表达量为菌体总蛋白量的30％，表达形式为包涵体，对该包涵体进行溶解和复性，再经阴离子交换柱纯化，获得的重组蛋白的纯度可达90％以上。免疫印迹鉴定结果证实，该表达蛋白可与抗TNF—α抗体产生免疫反应。体外杀伤活性检测显示，该蛋白已完全丧失了新型TNF—α的体外杀伤活性。结论：上述实验证实，新型rhTNF—α免疫抑制剂构建成功，该免疫抑制剂既保持了与TNF—α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性，为其下一步治疗作用的研究打下了基础。     

hTNFA-hPgnK5融合蛋白的原核表达及测定

目的　获得 h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因 ,在原核细胞中表达融合蛋白 ,探索其活性 .方法　 PCR法改造h TNFα基因 ,消除其终止密码子 ,构建 h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因 .在大肠杆菌 DH5α中表达该融合蛋白 ,测定其体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性 .结果　 h TNFα基因经 PCR法改造 ,去除了终止密码子 ,并在 3 端引入 Bam HI位点 .h TNFα- h Pgn K5融合蛋白基因构建完成 ,并在原核系统中获得表达 ,免疫印迹反应表明该融合蛋白具有 h Pgn K5免疫活性 .体外实验表明该融合蛋白可抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的增殖 .结论　 h Pgn K5蛋白可与 h TNFα一起表达 ,该融合蛋白有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性     

重组胸腺素α1的克隆、表达与纯化

目的 利用基因工程方法表达胸腺素α1（thymosin alpha 1,Tα1）的串联体并进行纯化、鉴定。方法 将Tα1的基因拆发为4个片段进行合成,退火后经PCR获得串联体基因,测序正确后克隆在硫氧还蛋白（thioredoxin)融合蛋白表达载体pThioHisA中,转化大肠杆菌TOP10菌株,IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经过80℃热处理及阴离子交换柱Q－Sepharose Fast Flow进行纯化,Western-blot进行鉴定。结果 获得了纯化的Thioredoxin-Tα1③,分子质量约为31ku。结论 用基因串联思路表达小分子多肽是一种可行的方法,Tα1③的成功表达为检测其生物学活性奠定了基础。     

21卷5期疑难病案

患者,22岁。因足月产后20天,反复阴道大流血,于1996年10月12日由基层医院转入。患者20天前在基层医院自然分娩1活女婴,产时顺利。胎儿娩出30分钟后胎盘未娩出,即行手剥胎盘,完整娩出。产时出血不多,产后7天阴道突然流血,量约200ml,当地医院疑胎盘残留,行清宫术,术中出血约300ml。给予输液、抗感染、促宫缩治疗,阴道流血减少,3天后出院。1周后再次流血,量多,又回医院清宫。术中大出血,约800ml,伴休克。给予输血600ml及抗休克治疗,病情稍好转,但阴道流血未见明显减少,即转入我院。既往体健,G1P1,孕期无异常。入院查体:体温36.8℃,脉搏116/min…     

重组人PD-1IgV融合蛋白的克隆、表达、纯化及生物学活性检测

目的:获得具有生物学活性的重组人PD-1IgV(rhPD-1IgV)蛋白.方法:人工合成PD-1IgV基因,并将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中.转化宿主细胞大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达重组融合rhPD-1IgV蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:rhPD-1IgV的Mr约为15×103,与根据其氨基酸组成计算的理论值一致.成功纯化了rhPD-1IgV蛋白,并对其进行了复性和浓缩,且复性后的蛋白可与其配体B7-H1结合,显示出良好的结合活性.结论:成功地克隆、表达和纯化了rhPD-1IgV蛋白.     

多聚抗原肽免疫磁珠在制备单表位抗体中的应用

目的： 建立用多聚抗原肽（multiple antigen peptides, MAP）包被磁珠制备单表位抗体的方法.方法： 通过Fmoc法固相化学合成UreB的8分支单表位MAP, 将其作为免疫原免疫小鼠, 获得多克隆抗血清.将MAP以共价偶联的方式包被磁珠制备免疫磁珠（immunomagnetic beads, IB）, 通过IB从多克隆抗血清中纯化单表位抗体, 荧光偏振（fluorescence polarization, FP）法鉴定抗体的特异性, SDS-PAGE鉴定抗体纯度, 紫外分光光度法测定其回收率.结果： 合成的MAP具有较强的免疫原性, 免疫小鼠后得到的抗体滴度高达1∶ 12 800.MAP制备免疫磁珠的最佳包被浓度为100 mg/L, 包被效率最高可达79%.应用MAP免疫磁珠从抗血清中纯化得到的单表位抗体, 经鉴定与其他抗原表位无反应性, 其纯度为95%, 抗体的回收率为5.8%.结论： MAP包被的磁珠可快速分离纯化出针对某一抗原表位的特异性抗体, 其性质类似单克隆抗体.这一方案在快速制备少量高特异性抗体中具有广阔的应用前景.     

应用DNA多态性分析21三体患者额外染色体的起源

21三体是儿童最常见的染色体异常疾病,也是智力低下最常见的遗传因素,鉴定其额外染色体的来源有助于阐明该病的发生机理。过去20年主要根据染色体核型分析,由21号染色体短臂的形态变化推测额外染色体的来源,发现母源性者约占80%,父源性占20%。然而细胞学受形态变异所提供信息多少的限制,且评价带有主观性。     

新型重组人肿瘤坏死因子工程菌的发酵工艺研究

目的研究并建立新型重组人肿瘤坏死因子 (nrhTNF)的发酵工艺。方法通过探讨nrhTNF工程菌在试管和锥形摇瓶中的生长和表达规律 ,筛选并确定其最适宿主菌、最佳培养基及最佳诱导表达条件 ,然后在 5L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果nrhTNF工程菌在 5L发酵罐中培养至终密度A60 0nm30左右时 ,目的蛋白的表达最高 ,保持在菌体总蛋白的 5 0 %附近 ,发酵时间为 12～ 13h。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺 ,为nrhTNF的工业化生产奠定了基础。     

含凝血酶切点的hTNFα—hPgnK5的原核表达及活性鉴定

目的 在原核细胞中表达融合蛋白hTNFα-hPgnK5并鉴定其活性,方法 构建hTNFα-hPgnK5基因的表达载体。并在大肠杆菌DH5α中进行表达,以MTT法测定该融合蛋白体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性。结果 成功地构建了hTNFα-hPgnK5的免疫活性。体外实验表明,该融合蛋白具有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性。结论 hPgnK5蛋白可与fhTNFα可共同表达,表达产物可抑制肿瘤细胞和血管内皮细增殖。