人红细胞凝集型单抗的制备与鉴定

目的制备人红细胞凝集型单克隆抗体并进行鉴定。方法以3种方式处理人血红细胞,获得红细胞免疫原,分别免疫Balb/c小鼠。应用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以凝集实验筛选分泌凝集型抗体的杂交瘤细胞,继而用有限稀释法克隆3次,并对杂交瘤细胞的稳定性进行测定。通过腹水法制备抗体,亲和层析法纯化抗体,对抗体的特性进行研究。结果 3种方式获得的免疫原均能建立有效的免疫反应,低渗加超声破碎法所获得的小鼠血清抗体效价最高。通过融合获得8株可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,其中,4A1分泌的抗体凝集效价最高。抗体可使4种人血型的红细胞凝集,无种属交叉凝集反应。结论有效制备了针对人红细胞的凝集性单抗,为其之后的应用研究奠定了基础。     

放免技术分析MCAb 3D3与肺腺癌细胞株的体外结合特性

本文利用氯胺T碘标技术对肺癌单抗(McAb 3D3)体外结合特性进行分析,McAb 3D3与肺腺癌细胞株L342的结合常数为3.2×10~8mol~(-1),每个L342细胞表面McAb 3D3的平均结合位点数为2.5×10~6个。RIA观察各种处理因素对L342细胞表面结合位点与~(131)I-McAb 3D3结合抑制率的影响,1％NaIO4、0.2％蛋白酶K、100％甲醇和100％丙酮的结合抑制率分别为72％、46％、14％和16％。结果提示,McAb 3D3所针对的3D3抗原是一种糖蛋白。     

抗CD5单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定

目的构建高表达的抗CD5单链抗体(scFv anti-CD5)工程菌,为开展以抗CD5单链抗体为构件的肿瘤免疫治疗研究奠定基础。方法从Genbank中获得抗CD5单克隆抗体H65的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因序列,用连接肽的编码序列连接,用重叠PCR技术获得目的基因,酶切后插入pET22b(+)构成重组质粒。测序正确的重组质粒转入E.coliBL21(DE3)诱导表达,产物经Ni-NTA柱纯化后复性,流式细胞术和Western blot-ting检测活性。结果获得序列正确的重组质粒,工程菌表达量高,产物复性后具有识别CD5抗原的活性。结论成功构建了高表达scFv anti-CD5的工程菌,为scFv anti-CD5的应用奠定了基础。     

肺癌靶向通用载体hu3D3/cSA融合蛋白的制备和活性分析

目的 制备一种新型的肺癌靶向通用载体hu3D3与核心链霉亲和素(core-streptavidin,cSA)的融合蛋白hu3D3/cSA,并鉴定其活性.方法 PCR扩增cSA基因,克隆至质粒hu3D3/pET-22b(+)而获得表达载体hu3D3/cSA/pET-22b(+),并在E. coli BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱纯化hu3D3/cSA融合蛋白,采用TEA缓冲液进行复性.SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白四聚体的形成.FITC标记hu3D3/cSA,通过荧光显微镜分析hu3D3组分的抗原反应性和特异性,流式细胞术比较hu3D3/cSA和hu3D3与靶点的结合能力;ELISA和Western blot鉴定cSA组分结合生物素(biotin)的能力.结果 获得序列正确的hu3D3/cSA/pET-22b(+)重组子,融合基因在E.coli BL21(DE3)中主要以包涵体的形式表达.纯化复性后的融合蛋白能够形成四聚体复合物,保留了cSA结合生物素的活性,hu3D3组分能与肺癌细胞表面抗原结合,且结合能力与单体hu3D3相比有明显增强.结论 成功制备了具有结合靶抗原和生物素活性的hu3D3/cSA融合蛋白,同时改善了hu3D3组分结合其靶点的亲合力(avidity).因此,hu3D3/cSA可以作为一个通用的肺癌靶向载体,与多种生物素化的抗肿瘤药物或试剂联用,有望为多药物联合靶向治疗肺癌提供一种可行的方法.     

MTT比色法在测定细胞活性中的影响因素

ＭＴＴ比色法在测定细胞活性中的影响因素郑耘，杨善民，颜江华，陈瑞川关键词：ＭＴＴ，甲化合物，细胞活性细胞活性检测试验一直是肿瘤药敏实验中的一项常规工作，目前采用的方法有多种，其中关于染色法、同位素法、集落形成法的研究较多，由于这些方法均有不少缺点，使...     

标记抗人肺癌单抗超顺磁性氧化铁粒子的磁共振免疫显像实验

探讨标记抗人肺癌单抗的超顺磁性氧化铁微粒进行磁共振免疫显像的可能性。材料与方法：将采用Ｆｅ与Ｆｅ混合液在碱性条件下制备ＳＰＩＯ微粒；将粒径４．５ｎｍ±３．４ｎｍ的ＳＰＩＯ微粒标记到抗人肺癌单抗上；观察静注ＳＰＩＯ－ＭｃＡｂａ定向改变截瘤裸鼠ＭＲ信号强度的可能性。     

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽介导截短组织因子治疗大肠癌的实验研究

目的 以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽重复序列作为截短组织因子(tTF)的载体,表达(RGD)_3-tTF融合蛋白,研究(RGD)_3-tTF融合蛋白对大肠癌的治疗作用.方法 用3个串联的RGD多肽作为tTF的载体,构建(RGD)_3-tTF融合基因,在大肠杆菌BL21(DE_3)上表达并用镍柱纯化(RGD)_3-tTF融合蛋白.在体外通过凝血实验检测(RGD)_3-tTF融合蛋白的凝血活性.建立大肠癌小鼠动物模型,异硫氰酸罗丹明B(RBITC)标记(RGD)_3-tTF、tTF融合蛋白,运用活体成像技术和共聚焦显微镜观察分析融合蛋白在大肠癌小鼠模型体内的定位.观察检测(RGD)_3-tTF融合蛋白抑制肿瘤生长的能力.结果 在Ca~(2+)存在时,随着(RGD)_3-tTF融合蛋白浓度的增加,凝血时间相应缩短,浓度为6μmoL/L时凝血时间是(8.6±0.2)min,而浓度为0μmol/L时凝血时间＞30 min(P＜0.05).(RGD)_3-tTF融合蛋白的凝血活性与tTF相仿(F=0.09,P＞0.05).活体成像技术和共聚焦显微镜观察结果显示,注射标记了RBITC荧光的(RGD)_3-tTF融合蛋白富集在小鼠的肿瘤血管腔.抑瘤实验中,(RGD)_3-tTF融合蛋白能诱导肿瘤血管形成血栓,给药后第1、3、5天,(RGD)_3-tTF组的肿瘤体积分别为(120.8±4.8)mm~3、(93.8±3.4)mm~3、(132.2±7.7)mm~3,均显著小于tTF组[(181.4±13.8)mm~3、(333.0±32.0)mm~3、(514.0±11.5)mm~3]和磷酸缓冲液(PBS)组[(182.6±11.5)mm~3、(332.8±21.0)mm~3、(524.2±16.7)mm~3](P＜0.05),而tTF组和PBS组之间的肿瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功制备的(RGD)_3-tTF融合蛋白保留了组织因子的凝血活性并靶向定位在肿瘤血管,能诱导肿瘤血管形成血栓从而抑制肿瘤生长,有望成为治疗大肠癌的一种新方法.     

NRP-1单抗联合节律化疗对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制

目的：探讨NRP-1 单抗联合多西他赛节律化疗对胃癌裸鼠移植瘤的抗肿瘤疗效。方法：BALB/c裸鼠皮下接种胃癌BGC-823 细胞制备移植瘤模型,将荷瘤裸鼠以数字随机表法随机分为对照组、NRP-1 单抗组、节律化疗组(MCT)、联合组(NRP-1mAb+MCT),每组6 只。除对照组,其余各组于造模第8 天开始分别给予相应治疗,给药2 周,观察裸鼠一般状况,隔天测量裸鼠体重及肿瘤体积。裸鼠处死后称瘤质量,H-E 染色观察瘤组织形态,免疫组化检测裸鼠瘤组织中NRP-1 蛋白、VEGF、MVD表达。结果：联合组移植瘤的体积和质量显著低于其他各组[ （0.394±0.128）vs（0.748±0.152）、0.867±0.361）、（1.247±0.494）g;（0.613±0.223) vs (0.866±0.115)、(1.098±0.343)、(1.474±0.644) cm3。均P<0.05],抑瘤率较其他治疗组差异有统计学意义(P<0.05)。对照组癌组织细胞生长良好,血管丰富,给药组癌组织出现不同程度的片状坏死,血管成分减少。免疫组化染色显示,对照组NRP-1 表达明显高于治疗各组(P<0.05),联合组的NRP-1、VEGF、MVD表达均显著低于其余各组(P<0.05)。结论：NRP-1单抗联合多西他赛节律化疗可能通过下调NRP-1 表达而显著抑制BGC-823 胃癌移植瘤的生长及血管生成。     

肝癌单抗JH11－ADM交联物的制备及其细胞毒作用

以葡聚糖（Ｄｅｘ）为中间载体，通过碘酸氧化法制备阿霉素（ＡＤＭ）与肝癌单抗ＪＨ１１的交联物ＡＤＭ－Ｄｅｘ－ＪＨ１１，交联物中ＡＤＭ与ＪＨ１１的克分子比为７１：１．经ＩＦＡ测定交联物的抗体活性大部分保持。体外细胞毒试验显示，ＡＤＭ－Ｄｅｘ－ＪＨ１１对ＢＥＬ－７４０２细胞的杀伤作用比游离的ＡＤＭ强．其ＩＣ５０分别为０．９６μｇ／ｍｌ和１．５２μｇ／ｍｌ，对非靶细胞ＭＧｃ－８０３和Ｌ３４２的毒性很弱，它们的ＩＣ５０＞１０μｇ／ｍｌ．集落形成抑制试验表明，ＡＤＭ－Ｄｅｘ－ＪＨ１１在低浓度时即对ＢＥＬ－７４０２集落形成有显著抑制作用，ＩＣ５０为０．０６３μｇ／ｍｌ，结果提示，ＡＤＭ－Ｄｅｘ－ＪＨ１１具有选择性细胞杀伤作用．     

McAb3D3与平阳霉素交联物的制备及其细胞杀伤实验

用ＤｅｘｔｒａｎＴ４０为中介体的方法交联抗人肺腺癌单抗３Ｄ３和平阳霉素（Ａ５），每克分子抗体可携带６８克分子的药物，交联物中抗体活性仍能达到１０－４水平，能较好地与靶细胞Ｌ－３４２结合。体外细胞毒实验，显示交联物和游离Ａ５对靶细胞５０％杀伤浓度分别为０．９μｍｏｌ／Ｌ和４．６μｍｏｌ／Ｌ，杀伤效果比游离Ａ５强５倍多。单抗对靶细胞几乎没有杀伤作用；无关抗体交联物的作用也很弱。交联物和游离Ａ５对非靶细胞ＭＧｃ－８０３的杀伤作用无明显差别。结果提示ＭＣＡｂ３Ｄ３具有良好的导向作用，能携带结合的Ａ５特异地杀伤肺腺癌Ｌ－３４２细胞，可作为临床抗肿瘤药物导向治疗的一种载体。