人肺癌单克隆抗体3D3重链可变区cDNA克隆及序列测定

人肺癌单克隆抗体３Ｄ３重链可变区ｃＤＮＡ克隆及序列测定史依仁颜江华郭先健白雪峰单克隆抗体（ＭｃＡｂ）在科研及影像诊断等领域应用十分广泛，鼠源性单克隆抗体，对人是异种抗原，使其在人类疾病治疗方面的应用受到限制。利用基因重组技术，可构建各种重组抗体基因，...     

人源化抗人肺癌二价和四价VH单域抗体的制备及活性分析

目的为提高人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3vH的功能性亲和力,制备其二价和四价的抗体分子。方法重组PCR分别将SV5-Cys短肽和p53四聚化结构域基因与hu3D3VH基因融合,而获得同源二聚体dihu3D3VH和同源四聚体tehu3D3VH基因。将两种基因克隆至pET-22b( )表达载体,并分别在E.coli BL21(DE3)中表达。表达产物通过N2 亲和层析柱纯化。用FITC分别标记hu3D3vH、dihu3D3VH和tehu3D3V三种抗体分子,通过免疫荧光实验分析其抗原反应性和特异性,并利用流式细胞术比较分析其功能性亲和力。结果两种基因均以单体形式并主要以包涵体的形式表达,纯化并复性后,其蛋白溶液中分别存在约50%的二聚体和70%的四聚体。dihu3D3VH和te- hu3D3VH均保留了hu3D3VH的抗原反应性和特异性;且与hu3D3VH相比,其功能性亲和力分别提高了约60%和160%。结论采用增加结合价的策略,有效地改善了hu3D3VH的功能性亲和力。     

免疫杀手细胞的体外扩增方法及其对肝癌细胞BEL-7402的杀伤作用

目的:探讨免疫杀手细胞(immune-killer cells,IKCs)的体外扩增方法及其对人肝癌细胞BEL-7402的杀伤作用。方法:改良自然杀伤细胞培养扩增法扩增IKCs细胞,流式细胞仪分析IKCs表型,台盼蓝染色计数法观察细胞增殖状况,AlamarBlue法观察IKCs细胞对BEL-7402细胞的杀伤作用,用BALB/c裸鼠模型检测IKCs细胞对肝癌动物模型的治疗作用。结果:IKCs细胞培养14 d的细胞总数扩增300倍以上,主要由CD3~+CD56~+、CD3~-CD56~+和CD8~+细胞亚群组成,CD3~+CD56~+和CD3~-CD56~+比例达85%以上,CD8~+比例达到77%以上。IKCs细胞对肝癌BEL-7402细胞的杀伤实验显示,当效靶比为25:1时和100:1时,其杀伤活性分别为66.5%和97.8%(P<0.01)。裸鼠肝瘤模型治疗实验显示,IKCs细胞对早期和晚期人肝癌BEL-7402细胞裸鼠模型均有显著的治疗作用,与对照组比较,其抑瘤率达69%以上(P<0.01)。结论:本实验建立的肿瘤免疫杀手细胞IKCs的培养扩增方法是可行的、有效的,有望成为一种新的肿瘤免疫细胞治疗方法。     

用于肿瘤血管靶向治疗的RGD/tTF融合蛋白的表达及活性鉴定

目的：制备用于肿瘤血管靶向治疗的重组RGD／tTF融合蛋白，并鉴定其生物学活性。方法：利用PCR技术均建RGD与tTF的融合基因，克隆至表达载体pET22b（＋），在E．coliBL21（DE3）中表达，镍亲和层析柱纯化。凝血实验和FX活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性，间接ELISA分析RGD活性。结果：获得序列正确的RGD／tTF／pET22b（＋）重组子，融合蛋白在E．coliBL21（DE3）中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FX、引起血液凝固的功能，且能与α，β3特异性结合。结论：成功构建RGD／tTF／pET22b（＋）重组子，RGD／tTF融合蛋白具有TF活性且与d，B，特异性结合，为进一步研究其体内特异性诱发肿瘤组织血管栓塞功能创造了条件。     

钆标记抗入肺癌单抗的磁共振免疫成像研究

目的：探讨Ｇｄ标记抗肺癌单抗对荷瘤裸鼠的定向增强效应。材料与方法：用ＤＴＰＡ环二酸杆与抗肺癌单抗３Ｄ３和Ｇｄ＾３＋分别偶联,制备出Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＩｇＧ;建立６只荷瘤裸鼠模型;将Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＩｇＧ按２ｍｇ单抗／只的剂量从尾部脉内淳入;观察平扫扩注药后６小时瘤体磁共振信号。结果：Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＩｇＧ能选择性增加瘤灶的信号强度。结论：磁共振免疫成像为肺癌定性提供一种潜在新的方法。     

抗人肺癌单克隆抗体(3D3)的研制及其特性鉴定

本文用人肺腺癌组织免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,获得1株单克隆抗体(McAb 3D3)。Ig类测定为IgG_1型。杂交瘤培养上清液和腹水的效价分别为1∶10~3～10~4和1∶10~6。采用间接免疫荧光法(IFA)观察到McAb3D3主要与肺腺癌细胞株A549和L342反应,与其它组织肿瘤细胞株没有反应。ABC免疫酶染色试验显示McAb3D3主要与肺腺癌组织反应,与正常肺组织没有反应。     

NRP -1 b1/b2单克隆抗体对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响

目的：探讨神经纤毛蛋白1（neuropilin -1,NRP -1）在胃癌细胞 BGC823中的表达情况,并观察自主研发的抗 NRP -1 b1/ b2单克隆抗体（NRP -1 mAb）对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响。方法：基于实验室前期已成功制备出纯度和浓度均较高的 NRP -1 mAb。利用流式细胞术检测该抗体亲和性、细胞免疫荧光定位检测 NRP -1的分布及 NRP -1 mAb 特异性。建立胃癌移植瘤裸鼠模型,向移植瘤中注射不同浓度的 NRP -1 mAb,研究抗体对胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响。2周后根据瘤体大小得出抑瘤率。最后免疫组化分析癌组织内血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。结果：胃癌细胞 BGC -823上存在 NRP -1,且主要分布在细胞膜上,能与自制的 NRP -1 mAb 有效结合。通过动物实验,NRP -1 mAb 能有效抑制移植瘤的生长,高浓度抗体较低浓度对移植瘤抑制作用更明显,NRP -1 mAb 治疗组中 VEGF 表达较空白组低（P <0.01）。结论：胃癌细胞 BGC -823细胞膜上表达 NRP -1,NRP -1 mAb 能特异性结合胃癌细胞上 NRP -1蛋白,NRP -1 mAb 能抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长,且与浓度呈正相关,可能与下调 VEGF 表达有关。     

NRP-1mAb对胃癌细胞BGC 823增殖的影响

目的 观察自主研发的抗NRP-1 b1／b2 IgG单克隆抗体（NRP 1mAb）对胃癌BGC 823细胞生长的影响,并初步探讨可能的作用机制。方法 实验室制备NRP-1mAb,采用SDS-PAGE检测纯度。采用0、25、100、200、400 μg／ml NRP-1 mAb培养胃癌BGC-823细胞,光学显微镜下观察细胞形态学变化;采用MTT法、集落形成实验、流式细胞术观察胃癌细胞BGC-823的增殖、集落形成和凋亡的情况;Western blotting法检测NRP 1mAb作用后Akt、p38、ERK、JNK信号蛋白磷酸化情况。结果 SDS-PAGE检测显示,NRP-1mAb的纯度在95％以上。光学显微镜观察显示,NRP-1mAb作用后,BGC-823细胞形态呈凋亡改变。MTT实验显示,NRP-1mAb抑制BGC-823细胞的增殖作用呈浓度和时间依赖性（P＜0.01）。集落形成实验显示,不同浓度NRP-1mAb均能显著抑制BGC-823细胞的集落形成,其抑制率呈浓度依赖性（P＜0.01）。流式细胞术检测显示,不同浓度NRP-1mAb均明显促进BGC-823细胞凋亡,且大部分集中在早期凋亡。Western blotting检测显示,BGC-823细胞的Akt磷酸化受到抑制, ERK、p38、JNK的磷酸化水平无明显变化。结论NRP-1mAb能抑制胃癌细胞BGC-823的生长、促进凋亡,可能与抑制Akt磷酸化有关。     

(RGD)_3-tTF融合蛋白选择性结合结肠癌裸鼠模型肿瘤血管的实验研究

背景与目的：肿瘤血管作为肿瘤分子靶向治疗的靶点受到广泛的关注,近年来有报道称利用抗体（Ab@作为组织因子（TF@胞外区截短组织因子（truncated tissue factor,tTF@的载体,表达的抗体--截短组织因子（Ab-tTF@融合蛋白能够选择性结合肿瘤血管,诱发实体肿瘤组织血管栓塞,导致肿瘤衰退,但是该方法存在一些弊端。本实验旨在研究以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（GRGDSP,RGD@多肽作为tTF载体所表达的（RGD@3-tTF融合蛋白选择性结合结肠癌裸鼠模型肿瘤血管的能力。方法：用3个串联的RGD多肽与tTF合成融合基因（RGD@3-tTF,表达于大肠埃希菌（Escherichia coli,E.coli@BL21（DE3@,用镍柱纯化融合蛋白。用RGD-tTF融合蛋白作对照,通过凝血实验和凝血因子Ⅹ（FⅩ@活化实验检测（RGD@3-tTF融合蛋白的凝血活性,运用间接酶联免疫吸附试验（ELISA@方法分析其特异性结合肿瘤血管标志物整合素αvβ3的能力。结肠癌裸鼠模型分为3组（每组1只@,肿瘤组织分别用异硫氰酸荧光素（FITC@标记的（RGD@3-tTF、RGD-tTF融合蛋白、tTF进行荧光染色,免疫荧光实验分析融合蛋白在结肠癌裸鼠模型组织的定位。结果：（RGD@3-tTF融合蛋白保留了组织因子的凝血活性,在Ca2＋存在时随着融合蛋白浓度的增加,凝血时间相应缩短,浓度为6μmol/L时,凝血时间为（9.96&#177;0.56@min（与对照组比较,P〈0.01@。（RGD@3-tTF融合蛋白的浓度在1μmol/L以上时能有效活化FⅩ,其活化能力与RGD-tTF相似（F=0.147,P〉0.05@。同浓度（RGD@3-tTF融合蛋白与整合素αvβ3的结合能力强于RGD-tTF（F=164.81,P〈0.01@,当融合蛋白浓度为0.24μmol/L时,（RGD@3-tTF融合蛋白和RGD-tTF融合蛋白的A405nm分别为1.25和0.95。免疫荧光实验显示,（RGD@3-tTF融合蛋白富集于结肠癌裸鼠模型的肿瘤血管。结论：（RGD@3-tTF融合蛋白在保留组织因子凝血活性的同时通过高效、特异地结合肿瘤血管标志物整合素αvβ3,选择性地定位在结肠癌裸鼠模型的肿瘤血管上,为发展tTF作为效应因子的结肠癌分子靶向治疗奠定了基础。