一种神经元体外缺氧诱导凋亡模型的建立

目的： 在不改变细胞生长环境条件下，建立一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导细胞凋亡模型。方法：取新生鼠培养第 8 d 的皮层神经元，采用不改变原培养基成分，将细胞置于缺氧环境(密闭容器内，抽取成真空并维持 30 min，然后充95%N2、5%CO2)中分别培养0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0和 24 h 后，于不同时间取出， Hochest33258神经元核染色观察凋亡小体及凋亡细胞核，抽提DNA琼脂糖电泳检测DNA梯形条带，以明确导致皮层神经元凋亡的缺氧时间。结果和结论：缺氧 0.5 h 后即可见DNA梯形条带形成，缺氧 1 h 后即可见神经元细胞核固缩、细胞核凋亡小体形成。在不改变细胞培养基及其它成分的条件下，平均缺氧 1 h 即可诱导体外培养的神经元细胞凋亡，成功地建立起一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导神经元凋亡模型，而且重复性好，可以作为体外缺氧/缺血诱导神经元凋亡的良好平台。     

KIAA0280的亚细胞定位及在缺血脑组织中的表达

目的观察大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中KIAA0280蛋白的表达及亚细胞定位。方法应用免疫组织化学法测定KIAA0280在大鼠急性脑缺血后在缺血与非缺血区表达的差异,利用激光共聚焦扫描显微镜检测KIAA0280的亚细胞定位。结果免疫组织化学结果证实了KIAA0280在大鼠急性局灶性脑缺血后表达的差异,激光共聚焦扫描显微镜证实KIAA0280在大鼠皮层细胞。胶质细胞胞浆和细胞膜上均出现表达。KIAA0280在脑缺血后明显上调表达。结论KIAA0280与蛋白质合成和信号传递有密切关系,为新的脑缺血相关蛋白质,对其功能深入研究将对诊断和治疗脑缺血缺氧疾病奠定基础。     

应用mRNA差异显示技术筛选大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因

目的： 应用mRNA差异显示技术对大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因进行筛选，克隆以及鉴定。方法: 大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养；对大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型进行荧光mRNA差异显示逆转录PCR（FDDRT-PCR,fluorescent differential display RT-PCR）；EST片段亚克隆入pGEM-T EasyTM，克隆后测序并进行序列同源性检索；反Northern杂交重鉴定与筛选。结果: 通过DDRT-PCR获得164 个在小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达的ESTs；对其中的17个ESTs进行了克隆并测序；通过反Northern杂交的初步筛选初步鉴定出5个阳性片段。结论: 阳性差异表达EST的筛选、克隆以及鉴定为神经元凋亡与保护分子机制研究奠定基础。     

蝰蛇(缅甸亚种)毒凝血因子X激活物FVe-1的分离纯化与理化活性的研究

[目的]从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离纯化一种凝血活性因子X激活物FVe-1,并研究其理化性质、序列测定以及凝血活性.[方法]应用阳离子交换层析、分子凝胶过滤层析分离纯化蛇毒,采用MALDI质谱测定法测定分子质量,等电聚焦电泳测定等电点,Edman降解法测定蛋白N末端氨基酸序列,发色底物法和SDS-PAGE等方法测定FVe-1的酶学特征和凝血活性.[结果]从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离得到的F Ve-1为单体蛋白,相对分子质量为13 808,等电点4.6,0.5 mg FVe-1的凝血活性与1.5625 u的凝血酶或与54.93 ng RVVX的凝血活性相当;可激活FX,但对凝血酶和纤维蛋白原无作用;酶活性的适宜pH为6.5～ 7.5,适宜温度为25 ～ 60℃;为钙依赖性,凝血活性可被EDTA和DTT抑制;FVe-1的N端序列为NH2-N-L-Y-Q-F-G-E-M-I-N;具有呈剂量依赖性的促血浆凝固作用.[结论]从蝰蛇(缅甸亚种)毒纯化出一种F Ve-1是一个凝血因子X的激活物,可激活凝血因子X,但对凝血酶和纤维蛋白原的作用微弱.     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

小檗碱诱导大鼠神经元毒性死亡的研究

目的：研究小檗碱（Ｂｅｒ）对原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元的直接作用及Ｂｅｒ与间接胆红素的相互作用。方法：采用二乙酸荧光素（ＦＤＡ）和Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ＤＮＡ染色法，观察神经元的存活率及形态学特征；用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪分析Ｂｅｒ诱导神经元死亡的生化学特征。结果：Ｂｅｒ呈剂量（０～２０μｍｏｌ／Ｌ）依赖性地诱导原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元死亡。其死亡的机制呈现坏死的特征：包括神经元胞体肿大、无明显核染色质浓缩、ＤＮＡ随机断裂而在凝胶电泳图上呈弥散样改变、流式细胞仪分析未见凋亡峰。用蛋白质合成抑制剂预处理神经元，不能阻断Ｂｅｒ的神经毒性作用。无毒性剂量下的Ｂｅｒ（１μｍｏｌ／Ｌ）与无毒性剂量下的胆红素相加，可产生神经元的毒性。结论：Ｂｅｒ诱导原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元坏死，并增强胆红素的神经毒性作用。     

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤对低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的Ca2+/cAMP不依赖性保护作用

 目的观察3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX）对5 mmol·L^-1KCl诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的拮抗作用并探讨其与[cAMP]i 和Ca²⁺的关系。方法建立KCl 5 mmol·L^-1诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型,用荧光二酯素法分析神经元存活,Hoechest 33258核染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析凋亡,放射免疫法测定cAMP浓度。结果IBMX呈浓度依赖性拮抗5mmol·L^-1KCl诱导的神经元死亡,并明显减少核形态异常的神经元,使DNA电泳梯带变浅或完全消失;IBMX（1.0 mmol·L^-1）可持续升高神经元[cAMP]i,福司可林2.0μmol·L^-1升高[cAMP]i作用 与IBMX类似,但不能模拟IBMX的作用;此外,IBMX的拮抗作用不被cAMP 竞争性抑制剂Rp-cAMP和PKA的特异阻断药H-89阻断;单用或联用钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ的特异抑制剂KN-93和磷酯酰肌醇3位羟基激酶的特异性抑制剂LY294002也不能阻断。结论IBMX抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡作用不依赖cAMP和Ca²⁺。     

RNA干扰技术及其在神经科学中的研究进展

RNAi是一项崭新的分子生物学技术,是外源和内源性双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑制的现象。它既可以阻断特定基因的表达又参与基因表达的调控。在神经科学的研究中,我们利用RNAi技术可以方便快捷地研究脑学习和记忆的机制、信号的传导,建立神经性疾病的动物模型,甚至可以利用它来治疗某些神经性疾病。     

胆红素对原代培养不同类型大鼠神经元的毒性作用

目的　观察胆红素对大鼠不同类型神经元的毒性作用及机制。　方法　采用原代培养的大鼠小脑颗粒神经元、皮质神经元及海马神经元 ,观察低浓度 (0～ 17.1μm ol/ L)胆红素对其毒性的影响。用二乙酸荧光素染色法测定神经元存活率 ,荧光技术测定细胞内胆红素的含量。　结果　胆红素呈剂量依赖性地诱导小脑颗粒神经元死亡 ,在胆红素浓度为 4.3、8.6及 17.1μm ol/ L 时 ,颗粒神经元的存活率分别为 (5 0 .1± 3.1) %、(18.5± 2 .3) %和 (2 .0± 2 .4) % ;皮质神经元的存活率分别为(90 .7± 7.8) %、(85 .3± 5 .3) %和 (74.5± 2 .4) % ;海马神经元的存活率分别为 (75± 6 ) %、(6 2± 5 ) %和 (4 9± 5 ) %。胆红素对大脑皮质神经元及海马神经元的毒性明显低于颗粒神经元。加入胆红素 3h后 ,颗粒神经元、皮质及海马神经元细胞内胆红素的荧光强度分别为 33.4± 2 .3、10 .7± 3.0、2 1.9±4.3,小脑颗粒神经元内胆红素含量明显高于海马及皮质神经元 (P<0 .0 1)。　结论　小脑颗粒神经元较海马及皮质神经元对胆红素的毒性敏感 ,与细胞内胆红素含量不同有关     

IGF-1经PI3K/Akt依赖性途径保护苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡

目的　观察胰岛素样生长因子 1 (insulin likegrowfactor 1, IGF 1)对苯妥英(100μmol·L-1 )处理的大鼠小脑颗粒神经元 (cerebellargranularneurons, CGNs)存活率的影响,并探讨其与PI3K/Akt通路的关系。方法　体外培养 8的小脑颗粒神经元,同时给予 100μmol·L-1苯妥英和μmol·L-1 IGF 1, 48h后行凋亡分析,观察IGF 1对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元的保护作用;采用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002(50μmol·L-1 )预先与小脑颗粒神经元孵育 30min,再加 1μmol·L-1 IGF 1和 100μmol·L-1苯妥英共孵育 48h,测定神经元存活率,观察IGF 1与PI3KAkt通路的关系;Westernblot法检测苯妥因处理不同时间小脑颗粒神经元内磷酸化Akt水平及总Akt的表达量,并观察IGF 1对磷酸化Akt水平的影响,进一步探讨IGF 1的作用是否经PI3K/Akt通路。结果　①1μmol·L-1 IGF 1可明显抑制 100μmol·L-1苯妥英引起的小脑颗粒神经元的凋亡明显提高小脑颗粒神经元的存活率,使其凋亡特征消失。②PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002可取消IGF 1的保护作用。③苯妥英使小脑颗粒神经元内磷酸化Akt水平明显降低,但不影响总Akt表达量。④IGF 1可明显恢复被苯妥英抑制的磷酸化Akt的水平。结论　IGF 1保护苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡,这种