樟芝多糖通过ROS-NOX2-NLRP1信号减轻皮层神经细胞炎症损伤的作用研究

目的探讨樟芝多糖（ACP）通过抑制活性氧（ROS）-NADPH氧化酶2（NOX2）-NLRP1信号减轻皮层神经细胞（CNC）炎症损伤的作用和机制。方法在研究ACP抗炎症反应作用的实验中,将CNC分为对照组、脂多糖（LPS）组、ACP5mg/L组、ACP10mg/L组和ACP20mg/L组。对照组为常规培养的细胞,无LPS和ACP干预;LPS组用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应;ACP各组分别使用终浓度为5、10、20mg/L的ACP进行预处理6h后,再用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应。在研究ACP通过抑制ROS发挥作用的机制研究中,将CNC分为LPS组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组和NAC+ACP组。LPS组用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应;NAC组用10mMNAC预处理4h后,再用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应;NAC+ACP组同时用10mMNAC和20mg/LACP预处理4h后,再用0.1mg/LLPS诱导细胞炎症反应。采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,探针检测ROS的表达,Westernblot法检测NOX2、NLRP1蛋白表达水平,ELISA法检测培养基中IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平。结果ACP预处理后,与LPS组比较,ACP5mg/L组、ACP10mg/L组和ACP20mg/L组细胞活力均明显上调,细胞凋亡率均下调,细胞中ROS的荧光光度值均降低,NOX2和NLRP1蛋白表达水平均降低,IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低（均P＜0.05）。ROS抑制剂NAC预处理后,与LPS组比较,NAC组和NAC+ACP组细胞凋亡率均下调,细胞中ROS的荧光光度值均降低,NOX2和NLRP1蛋白表达水平均降低,IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均降低（均P＜0.05）;而NAC组和NAC+ACP组细胞凋亡率、细胞中ROS的荧光光度值、NOX2和NLRP1蛋白表达水平及L-1β、IL-6和TNF-α表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论ACP可以通过抑制ROS的表达来抑制NOX2-NLRP1的激活,从而减轻CNC的炎症反应。     

丁苯酞通过激活VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信号促进HUVECs形成血管

目的:探索缺血缺氧(H/I)条件下丁苯酞(NBP)通过激活血管内皮生长因子(VEGF)/VEGF受体2(VEGFR2)-Notch1/Delta样配体4(Dll4)信号促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成的机制。方法:利用无血清培养基和缺氧罐模拟H/I条件,HUVECs传代培养后设置正常对照(control)组、H/I组、NBP高剂量(H/I+NBP_(high))组和NBP低剂量(H/I+NBP_(low))组,其中control组为常规培养的HUVECs,H/I组为H/I条件下培养的HUVECs,H/I+NBP_(high)组为在H/I环境下使用20μmol/L丁苯酞干预的HUVECs,H/I+NBP_(low)组为在H/I环境下使用5μmol/L丁苯酞干预的HUVECs。CCK-8法检测各组细胞的细胞活力,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力,体外血管形成实验检测各组细胞成管能力,Western blot法检测VEGFR2、Notch1和Dll4的表达,ELISA法检测培养基中VEGF的表达,qPCR检测VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA表达水平。结果:丁苯酞可以提高H/I条件下HUVECs的存活率,促进细胞的迁移和体外血管的形成能力,且H/I+NBP_(high)组比H/I+NBP_(low)组更加显著。丁苯酞可以提高VEGF、VEGFR2、Notch1和Dll4的mRNA及蛋白表达。结论:丁苯酞可以在H/I条件下促进HUVECs形成血管,其机制可能与VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信号的激活有关。     

晚期胃癌患者肿瘤组织及外周血中肺耐药相关蛋白mRNA的表达与DCF化疗方案的疗效及预后的关系

目的探讨晚期胃癌患者肿瘤组织及外周血中肺耐药相关蛋白(LRP)m RNA的表达水平对接受DCF化疗方案(多西他赛+顺铂+氟尿嘧啶)的疗效及预后的预测作用,为临床晚期胃癌的治疗提供参考。方法收集嘉兴市第二医院2015年1月至2017年6月收治的58例晚期胃癌患者为研究对象。所有患者均接受DCF化疗方案姑息治疗。采用实时荧光定量PCR法(RT-QPCR)法对患者胃癌组织和外周血中LRP m RNA的表达进行检测。以外周血和肿瘤组织中LRP m RNA表达的中位数(分别为0.45和0.50)为界,分为高表达和低表达两组,比较患者的化疗缓解率、肿瘤进展时间(TPP)、中位总生存时间(OS)。采用SPSS 17.0软件包进行秩和检验、χ~2检验,预后影响因素采用Cox回归进行分析。结果肿瘤组织中LRP m RNA低表达患者的TPP和OS(中位数分别为7.8和12.7月)显著高于高表达患者(中位数分别为6.2和10.1月);外周血中LRP m RNA低表达患者TPP和OS(中位数分别为7.6和13.4月)显著高于高表达患者(中位数分别为6.4和10.8月);肿瘤组织及外周血共同低表达的患者TPP和OS(中位数分别为8.0和13.8月)显著高于高表达患者(分别为6.0和9.7月),差异均有统计学意义(P0.01)。Cox回归分析结果显示,肿瘤组织或外周血中LRP m RNA高表达(HR=2.44,95%CI:1.22~4.70;HR=2.40,95%CI:1.10~4.58)及肿瘤组织和外周血中LRP m RNA共同高表达(HR=1.62,95%CI:1.38~4.83)是影响OS的独立不良预后因素。结论 LRP m RNA的高表达可能与DCF化疗的耐药相关,LRP m RNA的检测可以作为化疗效果及预后的预测指标之一,有助于晚期胃癌患者的化疗个体化治疗。     

断痫方颗粒剂对慢性癫痫小鼠的干预作用及P450酶系统的影响

目的:研究断痫方颗粒剂对于慢性癫痫小鼠的行为学、海马体谷氨酸阳性细胞的干预作用及肝脏P450酶的影响。方法:戊四氮构建慢性癫痫小鼠模型,设置正常对照组、模型组和断痫方颗粒剂高、低剂量组。记录各组实验期间的发作次数、全身强直痉挛发作时间、Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力,免疫组化法检测小鼠海马体谷氨酸阳性细胞的表达,q PCR法检测小鼠肝脏P450酶系的表达,Elisa法检测脑组织中MDA、GSH-Px水平。结果:与模型组比较,断痫方颗粒剂各组癫痫发作的次数显著减少(P<0.05或P<0.01),Morris迷宫实验结果显示断痫方颗粒剂各组在Morris水迷宫实验的表现优于模型组(P<0.01)。免疫组化结果显示断痫方颗粒各组谷氨酸阳性细胞表达明显低于模型组。Elisa结果显示断痫方颗粒剂各组脑组织MDA表达显著降低,GSH-Px表达显著升高(P<0.05或P<0.01),断痫方颗粒剂高剂量组肝脏CYP1A2、CYP2E1、CYP2CⅡ、CYP3A1酶表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:断痫方颗粒剂对慢性癫痫小鼠有着很好的治疗作用,高剂量下会抑制肝脏P450酶表达,临床应用中应注意剂量的调整。     

樟芝多糖对6-OHDA构建的帕金森小鼠模型的行为及抗氧化损伤/抗炎能力的影响

目的：探索樟芝多糖对于6-OHDA诱导的的帕金森小鼠脑组织抗氧化/抗炎能力及行为学的影响。方法：6-OHDA毁损MFB构建帕金森小鼠模型,小鼠分组为：对照组、6-OHDA组、实验组(50、100、200mg/kg),腹腔注射给药。游泳实验和水迷宫实验观察行为学变化,Elisa法检测纹状体GSH-Px、SOD、CAT、LDH、MDA含量和炎症因子IL-6、IL－1β表达。结果：与6-OHDA组相比实验组的小鼠的GSH-Px、SOD、CAT、LDA有不同程度上升,MDA、IL-6和IL－1β有不同程度的下降。小鼠的认知、行动能力得到明显的改善。结论：樟芝多糖可以一定程度上改善6-OHDA的帕金森小鼠行为学,其原因可能与多糖具有抗氧化抗炎的作用有关,多糖可以提高了脑组织抗氧化能力,减少炎症因子表达。     

乙醇分级沉淀的樟芝多糖对于小鼠急性肝损伤的保护作用

目的 研究不同浓度乙醇沉淀获得的樟芝多糖对于急性肝损伤小鼠的保肝作用。方法 采用不同浓度的乙醇沉淀获得樟芝多糖,建立D-氨基半乳糖的急性肝损伤小鼠,Elisa法检测各组血清的谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）的表达以及肝组织中SOD、CAT、GSH-Px、GSH的表达,肝脏HE染色检查组织病理,qPCR检测肝组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA的表达。确定樟芝多糖中对于小鼠急性肝损伤有效的部分。结果 樟芝多糖的各浓度的乙醇沉淀物均有一定的保肝作用,其中90%乙醇沉淀的多糖对于小鼠模型ALT、AST的含量具有显著的降低作用且优于其他组多糖（P<0.05）。4种多糖可以显著降低血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、和肝组织中Bax、Caspase-3mRNA的表达,提高白介素-10（IL-10）和肝组织中SOD、CAT、GSH-Px、GSH蛋白表达以及Bcl-2mRNA的表达（P<0.05）。且PW90多糖效果较好。结论 不同浓度乙醇沉淀的樟芝多糖对于急性肝损伤有着一定的保护作用,90%乙醇沉淀获得的多糖保肝作用优于其他浓度乙醇沉淀获得的多糖。     

基于Wnt/β-catenin信号对胡椒碱抗肿瘤作用机制的研究

目的 研究小剂量胡椒碱通过下调Wnt/β-catenin信号分子的表达调控胃癌细胞HGC-27增殖及侵袭的机制。方法 体外培养人胃癌HGC-27细胞,设置梯度浓度的胡椒碱,CCK-8法检测24 h细胞的活力,流式细胞术检测细胞凋亡率。将细胞分为正常组（HGC-27）细胞、对照组（Wnt/β-catenin抑制剂组）、实验组（小剂量胡椒碱）。CCK-8法检测12,24,48 h细胞的活力,BrdU标记流式细胞术检测细胞增殖率、划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,Western-blot法检测Wnt/β-catenin信号分子的表达以及MMP2、MMP9和N-cadherin的表达水平,RT-qPCR检测β-catenin、MMP2、MMP9、N-cadherin的mRNA表达水平。结果 5 μmol·L^-1的胡椒碱可以抑制细胞的增殖但无明显细胞毒性,可以显著降低HGC-27细胞的增殖能力,且具有时间依赖性,相比正常组差异具有统计学意义（P<0.05）。划痕试验和Transwell小室试验结果显示,5 μmol·L^-1的胡椒碱可以降低HGC-27细胞的迁移能力和侵袭能力,相比正常组差异具有统计学意义（P<0.05）。胡椒碱可以显著下调Wnt/β-catenin信号分子的表达,以及关键蛋白MMP2、MMP9、N-cadherin的表达水平,相比正常组差异具有统计学意义（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,β-catenin、MMP2、MMP9、N-cadherin的mRNA表达水平相比正常组显著下调（P<0.05）。结论 小剂量的胡椒碱可以通过下调Wnt/β-catenin信号分子的表达调控胃癌细胞HGC-27的增殖及侵袭,可能是胡椒碱抗肿瘤的作用机制之一。     

艾地苯醌对帕金森病小鼠行为学改善的作用及其机制

目的 研究艾地苯醌对于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的帕金森病小鼠行为学改善的作用及可能的机制。方法 将小鼠分为对照组,模型组,艾地苯醌高、低剂量组。除对照组外,其余组别连续1周注射20 mg·kg^-1的MPTP诱导小鼠帕金森病,低剂量组小鼠每日给予艾地苯醌5 mg·kg^-1,高剂量组小鼠每日给予艾地苯醌10 mg·kg^-1,模型组给予等体积的生理盐水,连续干预14 d,对照组小鼠常规饲养。小鼠行为学实验采用旷场实验、爬杆实验、转轮实验、游泳实验、悬挂实验。免疫组化法检测小鼠黑质酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表达,Nissl染色检测小鼠中脑蛋白合成能力,MDA、SOD试剂盒检测小鼠黑质氧化损伤的水平,TUNEL染色检测小鼠黑质神经元的凋亡,免疫荧光法检测小胶质细胞IBA-1的表达,Western blot检测小鼠黑质中Bax、Bcl-2、caspase-9的表达。RT-QPCR检测线粒体DNA拷贝数mt-ND1以及线粒体DNA复制关键转录因子POLG1、POLG2、TFAM的mRNA表达水平。ELISA法检测小鼠外周血中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平。结果 模型组小鼠的运动能力相比对照组显著下降,且平衡感受到严重影响。艾地苯醌干预后,小鼠行为学得到显著改善,相比模型组具有显著性差异（P<0.05）。相比对照组,模型组小鼠黑质中TH、SOD的表达显著下调（P<0.05）、神经元凋亡率和MDA、IBA-1的水平显著上调（P<0.05）,外周血中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平显著上调（P<0.05）,Bax、caspase-9表达上调,DNA拷贝数以及相关转录因子表达下调。与模型组相比,艾地苯醌可以提高黑质中TH和SOD的表达,下调黑质中神经元凋亡率、IBA-1的表达以及外周血炎症因子水平,下调凋亡相关蛋白Bax、caspase-9,上调Bcl-2的表达,提高DNA的拷贝数和相关转录因子的表达。结论 艾地苯醌可以改善帕金森病小鼠的行为学,其机制和抗氧化应激损伤、抑制线粒体凋亡信号、改善线粒体损伤有关。     

樟芝多糖通过CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对小鼠非酒精性脂肪性肝病的保护作用

目的 研究樟芝多糖通过CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）的调控对小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的保护作用。方法 高脂饮食构建小鼠NAFLD模型,设置对照组、模型组、低剂量组、高剂量组。樟芝多糖干预1~4周中每周流式细胞术检测外周血Treg细胞的比例,谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的表达,外周血中转化生长因子β（TGF-β）、白介素-6（IL-6）的表达。樟芝多糖干预4周后,小鼠处死,取肝脏进行油红染色,Western blot法检测肝组织中TGF-β和Foxp3、Smad3蛋白的表达,RT-qPCR检测IL-6、TGF-β、Foxp3、Smad3的mRNA表达。结果 高脂饮食喂养4周后成功构建NAFLD小鼠模型,且模型组中Terg比例显著低于对照组（P<0.05）,樟芝多糖干预后Treg比例相比模型组显著增高（P<0.05）,小鼠肝功能得到显著改善,外周血中TGF-β表达上调、IL-6的表达下调,肝组织中TGF-β和Foxp3、Smad3蛋白和mRNA均上调,而IL-6的mRNA表达下调。结论 樟芝多糖可以通过Treg和TGF-β-Smad3信号对NAFLD起到保护作用,作用机制和免疫改善有关。