DNA依赖蛋白激酶催化亚基与细胞周期蛋白T2相互结合的鉴定

目的鉴定与DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNAPKcs)相互结合的蛋白,以深入探讨其生理功能。方法通过免疫共沉淀获得DNAPKcs的相互结合蛋白复合物,SDSPAGE电泳分离蛋白,肽质指纹分析和Western印迹鉴定蛋白。结果以DNAPKcs抗体进行免疫共沉淀从HeLa细胞中获得DNAPKcs的相互结合蛋白,对部分结合蛋白进行质谱分析和蛋白数据库检索,发现转录延伸因子PTEFb的亚基细胞周期蛋白(cyclin)T2是其中之一。其后,通过Western印迹检测,进一步证实DNAPKcs与cyclinT2相互结合作用。结论首次发现DNAPKcs与cyclinT2的相互结合,提示DNAPKcs参与基因转录调控或转录偶联修复反应的生物学功能。     

α粒子诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱研究

背景与目的 :DNA修复系统在细胞基因组完整性维持中发挥重要作用 ,本研究探讨α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱变化。 材料与方法 :采用Cy5和Cy3分别标记的癌变细胞BERP35T4和亲本细胞BEP2D的cDNA探针与DNA修复基因cDNA微矩阵杂交、ScanArray3000扫描仪扫描和ImaGene3.0软件分析比较基因表达差异。 结果 :分析比较了人支气管上皮细胞癌变前(BEP2D)和后(BERP35T4)126个DNA修复相关基因的表达谱 ,发现细胞癌变后有10个修复基因的表达降低 ,这些基因分别参与DNA链断裂修复、核苷酸切除修复和碱基切除修复反应 ,3个基因(DNA_PKcs、SMUG和RAD18)表达上调。结论 :细胞DNA修复表达改变是辐射诱发细胞恶性转化的机制之一。     

吩噻嗪衍生物协同放射对HeLa细胞增殖的抑制效应比较研究

目的 探讨吩噻嗪衍生物对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用及与放射联合应用抑制肿瘤的协同效应。方法 采用MTT法和细胞克隆形成法检测细胞的增殖活性和细胞辐射敏感性。结果 比较了6种吩噻嗪衍生物对HeLa细胞增殖的抑制效应，发现化合物α-氯-N-二甲胺基乙基吩噻嗪（PTZD2）、α-三氟甲基-N-二甲胺基乙基吩噻嗪（PTZD3）和α-氯-N-二乙胺基乙基吩噻嗪（PTZD5）的作用比较明显，在10μmol／L浓度能产生出显著抑制效应，40-50μmol／L浓度作用3和4d，细胞增殖完全被抑制而死亡。PTZD2或PTZD3与放射联合应用，显示出明显抗HeLa细胞增殖的协同效应，10μmol／L PTZD3对2和4Gy照射细胞的增殖抑制的增强比分别为3．5和1．8。实验结果还表明，在照射前18h用药的协同作用更加显著。结论 吩噻嗪衍生物具有程度不同的抑制HeLa细胞增殖的作用，与放射联合应用具有抗肿瘤的协同效应，而且照射前18h用药的效应最佳。     

运用抑制消减杂交构建辐射诱导EST库

目的 克隆并鉴定低剂量辐射射诱导基因,为探讨低剂量辐射生物学效应分子机理提供有益信息。方法 0．5Gyγ射线照射人胚肺细胞后,用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridizaation,SSH)构建低剂量辐射诱导EST库。用反向Northern杂交法对库中SEST片段进行筛选,挑取阳性克隆测序,并在GenBank序列数据中进行同源性比较。结果 得到受照后表达升高90个EST序列,代表21个基因的转录产物,部分基因的功能已明确。从功能上分析,这些基因产物的生物学作用涵盖了细胞周期、信号转导、细胞骨架、代谢、蛋白合成等几个重要的细胞生物学代谢反应过程,显示出细胞对低剂量辐射反应过程的多样性。另外,实验还获得4个新cDNA序列。结论 利用抑制消减杂交技术,从辐射前后HEL细胞中,得到低剂量辐射诱导EST片段,它们与细胞周期、增殖、代谢、信号转导、应激反应等相关,这些基因可能在细胞的低剂量辐射效应中起到重要作用。     

DNA double-strand break repair and prediction of radiosensitivity of tumor cells

ＤＮＡｄｏｕｂｌｅ┐ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｒｅｐａｉｒａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｓＺｈｏｕＰｉｎｇｋｕｎ周平坤，ＳｕｎＷｅｉｊｉａｎ孙伟建，ＳｕｉＪｉａｎｌｉ隋建丽，ＹａｎｇＳｕｈｏｎｇ杨素红Ｆ...     

DNA-PKcs失活对c-Myc蛋白表达的影响

目的：通过DNA-PKcs表达抑制的细胞模型，研究DNA-PKcs与癌基因c-myc表达调控的关系。方法：利用siRNA技术或抑制剂建立DNA-PKcs表达抑制细胞模型，Western印迹检测DNA-PKcs和c-Myc蛋白表达变化，Northern印迹检测癌基因c-myc的mRNA表达，SEAP检测系统检测c-myc转录活性变化。结果：稳定表达DNA-PKcs siRNA的细胞DNA-PKcs蛋白和c-Myc蛋白表达明显降低，同时c-myc转录活性也被抑制，但c-myc在mRNA水平无明显变化。渥曼青霉素（wortmannin，0．2μmol／L）同样也可抑制c-Myc蛋白表达和转录活性，而对c-myc的mRNA表达无影响。结论：DNA-PKcs参与c-myc基因的表达调控，DNA-PKcs是一个潜在的肿瘤治疗靶分子。     

肿瘤谱阵列芯片技术分析人体不同癌组织hHBrk1基因的差异表达

目的检测不同肿瘤及其癌旁正常组织中hHBrk1基因的差异表达,为进一步研究hHBrk1基因对肿瘤生物学过程的影响提供线索。方法以154对正常及肿瘤组织(19种不同人体组织)和10种肿瘤细胞株的cDNA的肿瘤谱阵列芯片(Cancer profiling arrayⅡ)为研究材料,采用Northern杂交方法分析目的基因表达水平的差异。根据阳性结果收集临床肿瘤组织样本,用RT-PCR检测hHBrk1基因表达,以验证芯片结果的可靠性。结果154对组织及10个肿瘤细胞株均表达hHBrk1基因。其中肺肿瘤组织高表达hHBrk1基因,与正常配对肺组织表达丰度差异有显著性(P<0.01);在肾癌组织中的hHBrk1基因表达丰度低于配对肾组织(P<0.01)。RT-PCR证实8临床肺肿瘤组织中5例高表达hHBrk1基因。结论肿瘤谱阵列芯片技术能够快速检测hHBrk1基因在不同组织中的表达差异,hHBrk1基因可能与肺癌及肾癌的发生、发展有关。     

微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化

目的：构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体，并表达及纯化融合蛋白。方法：采用常规PCR并结合定点突变技术，对hHBrkl基因进行缺失和点突变；利用限制性内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-4T；IPTG诱导融合蛋白表达，通过谷胱甘肽一琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论：构建了包括氨基端缺失截短体hHBRK1-AN、羧基端缺失截短体hHBRK1-AC和点突变蛋白hHBRKl-S^56G^57在内的原核表达质粒，分离获得较高纯度的重组hHBRKl突变体融合蛋白，Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。     

α粒子诱发细胞癌变的纺锤体检测点功能分析

目的：通过分析人支气管上皮细胞BEP2D和其α粒子诱发的癌变细胞系BERP35T1和BERP35T4的纺锤体检测点功能，探讨纺锤体检测机制变化在辐射致癌中的作用。方法：用噻氨酯哒唑药物破坏细胞的微管结构，导致纺锤体形成受阻，在光学显微镜下计数有丝分裂细胞。结果：本实验观察的辐射诱发癌变细胞系中有的染色体数目相对稳定，有的不稳定，其中表现为多倍体细胞比例增高。通过分析纺锤体检测点机制，发现染色体数目异常(多倍体)比例高的癌变细胞BERP35T4(40％)在噻氨酯哒唑药物作用后12—24h，有丝分裂指数(MI)明显低于亲本BEP2D细胞和另一癌变细胞系BERP35T1，后二者细胞的多倍体率较低(5％)。结论：纺锤体检测点机制异常与α粒子照射诱发恶性转化细胞BERP35T4的染色体不稳定性相关。