两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。     

恰巧相爱

世上比老虎不吃肉、露水不沾鞋要难的事恐怕还有一桩——两人恰巧相爱。大多数的现实是:你爱我时我不爱你,我爱你时你不爱我。相比之下,动物真没有这么“拧”的,不需要情书短信眼泪玫瑰什么的,到了特定季节,自会抱得“美人”归。你说,人怎么就这么难搞定呢?看了些博客中的情感日记,多是千疮百孔,满目疮痍——为什么人就不肯安分地爱那个爱着自己的人?偏喜欢铤而走险,鸡蛋往石头上碰,难免头破血流,然后蘸着血泪写日记,内心留下永远好不了的伤疤。或者,是因为人的高级动物属性所决定,喜欢挑战有难度的事情?太顺理成章的爱情让我们乏味。而只有…     

雄激素应答元件陷阱DNA抑制PSA基因启动子的作用并诱导LNCaP细胞凋亡(英)

目的：研究雄激素应答元件陷阱DNA（AREdecoy）对前列腺特异抗原（PSA）基因启动子的抑制作用及其对前列腺癌细胞LNCaP细胞生长活性的影响,为前列腺癌的基因治疗寻求新的策略。方法:联合运用报告基因和陷阱DNA策略,构建含PSA基因5’侧启动子区640bpDNA的荧光素酶表达载体pGL3-PSA,ARE陷阱DNA共转染前列腺癌细胞株PC3-M。应用双荧光素酶测定系统,检测荧光素酶的表达活性。然后,应用2mg/LAREdecoy转染LNCaP细胞,通过相差显微镜观察细胞超微结构变化,MTT比色法检测细胞生长活性,DNAladder和流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡以研究AREdecoyDNA对前列腺癌细胞LNCaP细胞生长活性的影响。同时提取LNCaP细胞核蛋白,应用电泳迁移率变动分析(EMSA)检测AREdecoyDNA与雄激素受体的特异结合。结果:AREdecoyDNA显著抑制报告基因荧光素酶的表达,抑制率可达95%。EMSA显示AREdecoyDNA能特异与核蛋白中雄激素受体结合。LNCaP细胞转染AREdecoyDNA后,镜下观察部分细胞出现凋亡形态学的改变,细胞体外生长受到抑制,染色体DNA凝胶电泳可见明显梯形条带。转染48h的凋亡率为22.4%。结论:实验表明AREdecoyDNA能竞争结合雄激素受体(AR),阻断AR的作用而诱导LNCaP细胞凋亡,有可能为前列腺肿瘤的治疗提供新的策略。     

姜黄素对前列腺癌细胞LNCaP增殖的影响

目的:姜黄素对前列腺癌细胞株LNCap增殖和凋亡的影响。方法:用不同剂量的姜黄素分别处理LNCap细胞,显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡率;然后检测姜黄素处理LNCap细胞后培养液中总前列腺特异抗原（PSA）的变化,并用免疫印迹Westernblotting技术检测雄激素受体（AR）的表达。结果:姜黄素能够抑制前列腺癌细胞LNCap的增殖和生长,40μmol/L作用24h最强,细胞存活率为对照的40%;姜黄素诱导LNCap细胞凋亡,细胞形态呈凋亡特征,且40μmol/L作用最强,凋亡率为9.23%;姜黄素抑制LNCap细胞PSA表达,且40μmol/L姜黄素处理细胞24h对PSA表达的抑制作用最强,PSA含量仅为对照的20%;Westernblotting检测结果显示姜黄素抑制AR的表达,并且对AR表达的抑制程度依赖于姜黄素的浓度。结论:姜黄素抑制LNCap细胞增殖,诱导细胞凋亡,且表现出时间和剂量依赖性。姜黄素抑制LNCap细胞PSA与AR受体的表达。     

miRNA let-7a1真核表达载体的构建及对肺癌细胞增殖的影响

目的：构建miRNAlet-7a1真核表达载体,研究其在肺癌A549细胞株的表达及对A549细胞增殖的影响。方法：以人肺癌细胞A549的总RNA为模板,RT-PCR扩增miRNApre-let-7a1基因序列,将miRNApre-let-7a1基因克隆到真核表达载体pSilencerTM4.1-CMVneo中,构建成pSilencerTM4.1-let-7a1重组体。将pSilencerTM4.1-let-7a1表达载体瞬时转染肺癌A549细胞,RT-PCR法检测miRNAlet-7a1在转录水平的表达。根据miRBaseTargets数据库,查hsa-let-7a1靶序列,构建let-7a1靶序列-报道基因融合质粒pMIR-report-let-7a1T,与pSilencerTM4.1-let-7a1表达载体共转染A549细胞,通过荧光素酶活性检测pSilencerTM4.1-let-7a1质粒对其靶序列的作用。MTT法检测pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,对细胞增殖的影响。结果：pSilencerTM4.1-let-7a1真核表达栽体和let-7a1靶序列-报道基因融合质粒经酶切及测序鉴定正确。pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,经RT-PCR证明能有效表达miRNAlet-7a1。pSilencerTM4.1-let-7a1质粒和pMIR-report-let-7a1T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测,相对荧光素酶活性明显降低,表明pSilencerTM4.1-let-7a1转染A549细胞后,可表达let-7a1并具有生物学活性。MTT检测结果显示：pSilencerTM4.1-let-7a1转染后的A549活细胞数目明显减少。结论：成功构建了真核表达载体pSilencerTM4.1-let-7a1,转染肺腺癌A549细胞后能有效表达,miRNAlet-7a1基因过表达抑制A549细胞的增殖。     

四君子汤多糖分离纯化对IEC-6细胞迁移药效活性的影响

目的：本研究对四君子汤多糖进行提取和分离纯化,观察不同多糖样品对小肠上皮细胞（IEC?6）迁移的影响,从而进行多糖纯化过程的药效活性追踪,为探讨四君子汤多糖药效物质基础提供参考。方法：①四君子汤水提醇沉得到四君子汤多糖1;经Sevag法去蛋白得到四君子汤多糖2;经DEAE?52纤维素柱层析并超纯水洗脱得到四君子汤多糖3a;经Sephadex G?100葡聚糖凝胶柱层析并超纯水洗脱得到四君子汤多糖4a和多糖4b;并以苯酚?硫酸法检测各多糖样品糖含量（以葡萄糖计）。②凝胶渗透色谱法（GPC）检测四君子汤多糖3a、多糖4a和多糖4b纯度。③在IEC?6细胞迁移模型上,观察四君子汤多糖不同样品促进细胞迁移的药效活性。结果：4种多糖样品（四君子汤多糖1、2、3a、4b）糖含量分别为71.35%、75.45%、81.00% 和98.50%,其促进细胞迁移的最低有效剂量分别为200、100、50、30mg·L^?1;表明纯化步骤最多的多糖4b糖含量最高、药效最优,且GPC 法测得其为均一性多糖组分。结论：四君子汤多糖经不同纯化步骤后,糖含量和纯度提高,药效活性随之增强,研究结果为探讨四君子汤促进细胞迁移的药效物质基础研究提供参考。     

发展中医药学面对的若干基本问题

本文在评价２０世纪中医药学发展的同时,指出２０世纪中医药学所取得的绝大多数临床成果,均不足以揭示中医理论中最关键的“证”本质问题。作者对我国该领域研究的滞后,中药现代化科技产业与中医学发展的互动问题表示了深切的忧虑,提出加强中医药基础理论研究需要认识上的多维视角、创新意识和学术新流派。     

慢病毒介导的中性内肽酶对Aβ诱导的SK-N-SH细胞凋亡的影响

目的：探讨脑中性内肽酶（NEP）外源表达对神经毒物质β淀粉样肽（Aβ）诱导SK-N-SH细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体法将含中性内肽酶NEP的四质粒系统慢病毒载体转染293FT包装细胞,制备高滴度病毒载体,感染Aβ处理的SK-N-SH细胞,用Westernblotting方法检测NEP对Aβ的降解作用、MTT法检测细胞存活率、流式细胞术分析细胞凋亡情况、RT-PCR技术测定凋亡相关基因bcl-2及bax的表达及caspase-3活性检测。结果:胞内高表达的NEP能够显著降解Aβ,其降解程度与NEP的表达量有剂量依赖关系。细胞存活率及流式细胞术检测结果显示NEP高表达可减轻Aβ诱导的细胞凋亡,细胞存活率于感染病毒后48h最强,为对照的170%（P＜0.01）,NEP活性组的凋亡率为3.86%,低于对照组的6.41%;RT-PCR结果显示NEP对Aβ诱导的细胞凋亡保护作用可能是通过减少bax的表达,抑制了caspase-3的激活程度来实现的。结论:NEP可以降解Aβ,可以保护由Aβ沉积所致的神经细胞凋亡。     

慢性胃炎脾气虚证与脾胃湿热证的差异表达基因比较

目的：比较慢性胃炎脾气虚证与脾胃湿热证患者差异表达基因。方法:分别提取慢性胃炎脾气虚和脾胃湿热患者胃黏膜组织RNA各4例,逆转录荧光探针标记后杂交制作BiostarH-140s基因芯片。采用荧光值ratio、生物信息学、t检验等方法分析结果,实时荧光定量PCR检测部分相关基因。结果:获得差异表达基因245条,主要为营养物质消化吸收运输、物质能量合成代谢、细胞周期增殖分化、免疫反应等相关基因;有显著意义的差异表达基因77条;实时定量PCR检测10条基因,6条与芯片结果一致。结论:慢性胃炎脾气虚和脾胃湿热2个证型基因表达存在明显差异,提示中医的临床辨证分型与基因差异表达有一定关系。     

脾虚理论及其应用——脾胃学说传承与应用专题系列（4）

分别从脾虚的起源、古代有关脾虚理论的论述、临床脾虚证诊断标准和本质研究、脾虚相关动物模型复制和机制探讨及脾虚理论和本质研究存在的问题等方面对脾胃学说的脾虚理论及其应用进行梳理,并探讨了脾虚证的研究方向及思路。