浙江省汉族与畲族CYP2C19基因多态性研究

 目的 调查浙江省汉族与畲族CYP2C19基因多态性。方法 采用PCR体外扩增CYP2C19的两个多态性位点CYP2C19*2(m1)和CYP2C19*3(m2),m1的PCR扩增产物用Sma I酶切,m2的PCR产物用BamH I酶切,琼脂糖电泳检测。结果 汉族与畲族各种基因型出现频率为:wt／wt:0.412,0.411;wt／ml:0.345,0.387;wt/m2:0.108,0.055;ml／ml:0.081,0.123;ml／m2:0.054,0.018;m2／m2:0.000,0.006。汉族与畲族CYP2C19不同等位基因出现频率:wt:0.639,0.632;ml:0.280,0.325;m2:0.081,0.043。结论 浙江省汉族m2出现频率高于畲族,且差异显著(P<0.05);畲族ml出现频率高于汉族。CYP2C19各种基因型:wt／wt出现频率汉、畲两民族相近;wt／m2,ml／m2基因型汉族大于畲族;wt／ml,ml／ml畲族明显高于汉族。     

pcDNA3.1-UDPGT1A9表达质粒的构建及其转基因细胞系的建立

目的　为建立能稳定表达人葡糖醛酸转移酶UDPGT1A9蛋白的CHL UDPGT1A9转基因细胞系 ,并鉴定其对药物的葡糖醛酸缀合活性。方法　利用基因亚克隆技术 ,将UDPGT1A9cDNA从pREP9 UDPGT1A9构建到哺乳动物表达载体pcDNA3.1中 ,形成真核细胞表达重组子pcDNA3.1 UDPGT1A9,再转染于中国仓鼠肺细胞 (CHL细胞 )中 ,通过G4 18筛选阳性克隆 ,建立稳定表达UDPGT1A9的CHL UDPGT1A9转基因细胞系 ,并以山萘酚为底物 ,采用HPLC方法对其代谢活性进行鉴定。结果　建立了CHL UDPGT1A9转基因细胞系 ,通过HPLC分析其对山萘酚代谢活性为 (1.0 2± 0 .11) μmol·min- 1·g- 1蛋白 ,而对照CHL细胞对底物无明显代谢。结论构建完成的转基因细胞系能稳定表达人体葡萄糖醛酸转移酶UDPGT1A9,并具有对山萘酚的代谢活性     

人细胞色素P450 2B6的异源表达及活性分析

 目的获得有活性的人CYP2B6重组酶,用于进一步药物代谢研究。方法采用Bac-to-Bac杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统进行人CYP2B6重组酶的表达,采用His抗体进行蛋白质印迹分析。安非他酮作为底物进行重组酶活性测定,高效液相色谱法测定其含量。结果蛋白质印迹分析检测到带有His标签的CYP2B6重组酶的表达,重组酶对安非他酮的Km值为(138±42)μmol·L^-1,V_max值为(676±21)pmol·min^-1·mg^-1蛋白。结论杆状病毒表达系统能成功表达有活性的CYP2B6重组酶,可用来进一步研究在药物代谢中的作用。     

一步法分析细胞色素P450 2D6酶活性缺陷等位基因CYP2D6A和CYP2D6B

目的：ＣＹＰ２Ｄ６Ａ和ＣＹＰ２Ｄ６Ｂ是引起细胞色素Ｐ４５０２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）酶活性缺陷的最主要的等位基因，对ＣＹＰ２Ｄ６Ａ和ＣＹＰ２Ｄ６Ｂ的检测可准确（＞９２％）预测ＣＹＰ２Ｄ６慢代谢者。本研究利用等位基因特异扩增法，建立了一步ＰＣＲ法测定ＣＹＰ２Ｄ６Ａ和ＣＹＰ２Ｄ６Ｂ等位基因。方法：等位基因特异扩增法分析ＣＹＰ２Ｄ６Ａ和ＣＹＰ２Ｄ６Ｂ等位基因；右美沙芬作为探针药物测定表型。结果：经１３０例测定，说明本法更为快捷、更少污染。结论：本法的建立为该项测定应用于临床、指导临床合理用药奠定基础     

人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.方法利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子.在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34).PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量.Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性.结果PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34).结论在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白.     

毕赤酵母中表达HSA/IL1ra融合蛋白的产物不均一现象的研究

目的探索HSA/IL1ra融合蛋白在毕赤酵母中表达的产物不均一现象的原因及可能的影响因素.方法通过去糖基化和抑制糖基化实验验证不均一产物的由来,并考察了不同融合方式、不同克隆菌株、不同表达宿主对产物不均一现象的影响.结果糖基化不均一引起产物不均一现象,且在SMD1168中没有此类现象,个别毕赤酵母GS115克隆中也没有此现象.结论HSA/IL1ra融合蛋白在毕赤酵母中表达的产物不均一现象,是由于融合蛋白在毕赤酵母中表达时糖基化不均一引起的,且不同融合方式、不同克隆、不同宿主对该现象有影响.     

表达rhTNFR-Fc的CHO细胞的氨基酸代谢特征及氨基酸流加培养工艺研究

为提高表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)的CHO工程细胞的培养密度和目的蛋白表达,研究了葡萄糖和谷氨酰胺流加-批式培养工艺的细胞氨基酸代谢特征及游离氨基酸和大豆蛋白水解物的补加策略.通过补加葡萄糖和谷氨酰胺浓缩液分别维持其浓度为10 mmol/L和2 mmol/L左右,在不同阶段定期补加特定的氨基酸浓缩液或大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗,检测细胞培养上清中rhTNFR-Fc的表达.谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸等4种非必需氨基酸快速消耗,是CHO工程细胞增殖和目的蛋白表达的限制性底物.以游离氨基酸、游离氨基酸合并大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗可分别使细胞生长密度提高50%、100%,目的蛋白表达增加60%、125%,培养时程延长44%、66%,同时葡萄糖比消耗率、乳酸比生成率降低,谷氨酰胺的利用效率提高.     

共表达PXRLBD和SRC88以及PXR配体筛选的平衡透析模型的建立

孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR),属核受体NR1I亚家族.PXR可由配体活化,当配体(如外源药物)与其配体结合域(ligand binding domain,LBD)结合后,PXR被活化,招募辅调控因子(如人甾体受体辅活化因子-1,steroid receptor eoactivator-1,SRC-1)形成复合物,通过其DNA结合域(DNA binding domain)结合到药物代谢酶基因启动子的特定DNA序列上,从而调控CYP3A4等药物代谢酶基因的转录[1,2].     

人尿苷二磷酸葡醛酸转移酶1A6重组酶对酚类和羧酸类化合物与葡醛酸结合的催化活性

目的利用杆状病毒系统表达的人尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UGT)1A6重组酶对一些化合物进行葡醛酸结合研究,以筛选或验证UGT1A6重组酶的底物。方法采用HPLC法对底物或代谢物进行检测,并根据底物的减少来计算该酶对各底物的酶动力学参数。结果人UGT1A6重组酶能很好地催化α-萘酚、β-萘酚和儿茶酚的葡醛酸结合,但对托特罗定、对乙酰氨基酚、水杨酸、对氨基水杨酸、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、扁桃酸、布洛芬和萘普生无明显催化活性。结论人UGT1A6重组酶对平面的简单酚类化合物有明显的催化活性,但对结构复杂的酚类或羧酸类化合物活性不明显。     

金葡菌肠毒素C2的克隆表达及其生物学活性

目的克隆金葡菌肠毒素C₂全长基因，构建SEC₂的表达载体，实现其可溶性表达，并对纯化的rSEC₂蛋白的生物学活性进行研究。方法通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)从金葡菌FRI1230菌株基因中得到肠毒素SEC₂的基因，将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化。通过考察重组SEC₂对淋巴细胞的增殖作用及其对肿瘤细胞杀伤活性的影响，对其超抗原活性和免疫学活性进行研究。结果得到正确的肠毒素SEC₂基因序列并得到高效表达的融合蛋白，MTT法结果表明，重组SEC₂表现出良好的促淋巴细胞增殖活性，且能够增强淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结论本研究成功克隆了SEC₂基因，表达并纯化出具有抗肿瘤生物学活性的重组SEC₂蛋白，为进一步对其分子抗肿瘤作用机制进行研究以及构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。