基于水凝胶的基因组DNA固定法研究

目的：通过对人基因组DNA固定化的研究,探讨特异性高的单点共价固定方法,实现对人基因组DNA的反复利用。
方法：选取Mirzabekov等发明的DNA-水凝胶共聚化学法作为基因组DNA固定方法,使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,以(CH2)6-NH2氨基末端修饰的PCR产物及甲酸随机断裂修饰的pGEM-T-HLA-G质粒为模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其固定效率,并通过PCR法检测该固定方法的热稳定性。将该法初步应用于人类基因组DNA的固定和反复利用,对基因组DNA扩增的片段进行测序,排除突变可能。
结果：使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,实现了对质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复使用,该方法可以经受16轮的PCR扩增（每轮36个循环）。测序结果证实基因组DNA的扩增片段未发生突变。
结论：甲基丙烯酰胺凝胶法固定DNA的热稳定性好,特异性高,可用于全基因组测序及SNP检测。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的表达及生物学活性分析

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因,添加亲和纯化标签进行原核表达,并对表达产物进行生物学活性分析.方法 通过PCR从pGEM-T-SEC2质粒中亚克隆得到带有编码6个组氨酸的核苷酸序列的基因片断,构建了表达质粒pET-28a-SEC2,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达.利用亲和层析纯化rSEC2,并采用MTT法对纯化后的rSEC2和天然SEC2生物学活性进行研究和比较.结果 表达质粒pET-28a-SEC2通过测序,表明已连入正确表达目的蛋白的核苷酸序列.含有该质粒的表达菌株经IPTG诱导,产生约占菌体总蛋白40%的可溶性重组蛋白.SDS-PAGE显示,经Ni2 亲和柱纯化的目的蛋白达到了电泳纯.MTT法表明该rSEC2和天然SEC2均有显著的超抗原活性.结论 成功构建了pET-28a-SEC2表达质粒,获得了与天然SEC2有着类似超抗原活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤活性奠定了基础.     

CYP2C19遗传多态性与膀胱癌易感性关系的研究

目的：观察ＣＹＰ２Ｃ１９遗传多态性与膀胱癌易感性之间的关系。方法：根据ＣＹＰ２Ｃ１９两个突变位点和ＡＳＡ原理设计ＰＣＲ引物,对５０例膀胱癌患者和７０例正常对照者进行ＣＹＰ２Ｃ１９基因分析。结果：膀胱癌组ＣＹＰ２Ｃ１９慢代谢者２例,正常对照慢代谢者１１例;两组间比较差别有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。结论：ＣＹＰ２Ｃ１９可能参与膀胱癌前致癌物的活化。     

金黄色葡萄球菌肠毒素SEC2的纯化与活性研究

从金黄色葡萄球菌发酵液中纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）。发酵液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀、阴离子交换色谱和分子筛色谱，获得了纯度为90％的SEC2，总收率23％。体外刺激脾淋巴细胞增殖实验以及体外肿瘤细胞增殖抑制试验表明该蛋白具备良好的超抗原活性。     

细胞色素P450 2C19单碱基突变位点CYP2C19m1的分析

目的:CYP2C19ml是引起CYP2C19酶活性缺陷的主要等位基因,有83％左右的慢代谢者含有CYP2C19ml等位基因,本文试图建立一步PCR测定CYP2C19ml等位基因的方法。方法:根据等位基因特异扩增(ASA)原理设计两对分别特异扩增野生型等位基因和突变型等位基因的引物,建立了一步PCR测定CYP2C19ml等位基因的方法。结果:对39位随机受试者进行了基因分型研究,发现3位CYP2C19ml纯合子、18位CYP2C19ml杂合子,其余18位为野生型纯合子。结论:说明效法能够用于测定CYP2C19ml等住基因,并且证明该法具有简便、快速和污染少的优点。     

利用高效液相制备柱分离胸腺素α1

利用高效液相C18反相制备柱，从小牛胸腺中分离到实验室制备量的胸腺素α1．ELIsA检测有免疫 学活性，等电聚焦电泳为一条谱带，微量玫瑰花结试验表明，0.10 μg本法制备的胸腺素α1，即具有促进T淋巴 细胞成熟的作用。     

利用右美沙芬区分细胞色素P4502D6纯合子与杂合子快代谢者

本研究目的是建立准确的细胞色素P450 2D6(CYP2D6)的右美沙芬表型测定法,以发现CYP2D6纯合子与杂合子快代谢者的表型差异。通过提高右美沙芬的检测灵敏度(1ng·mL^-1)而建立的HPLC分析法,对已知基因型的3组共168位受试者进行表型测定。结果发现不仅快代谢者与慢代谢者在代谢率上有很大差异,纯合子快代谢者与杂合子快代谢者之间在代谢率上也有差异。提示CYP2D6基因表达时,基因拷贝数起一定的作用。     

利用电泳滴定曲线选择多核苷酸磷酸化酶快速离子交换层析的最佳条件

目的 :选择多核苷酸磷酸化酶快速离子交换层析的最佳条件。方法 :制备大肠杆菌提取物的电泳滴定曲线 ,根据该曲线选择快速离子交换层析MonoSI柱的洗脱缓冲液的pH。结果 :根据该滴定曲线选择pH 8.0作为快速离子交换层析MonoSI柱的洗脱缓冲液的pH ,在该条件下只一步层析 ,得到的多核苷酸磷酸化酶的比活性提高2 50 0倍。结论 :电泳滴定曲线法能够用于离子交换层析的最佳条件的选择     

ASA法测定细胞色素P450 2D6酶缺陷等位基因CYP2D6E

目的 :建立细胞色素P4 50 2D6(CYP2D6)第 3 0 2 3位A→C突变造成CYP2D6酶活性缺陷的等位基因CYP2D6E的测定方法。方法 :利用等位基因特异扩增法 (ASA)为基本原理 ,设计两对引物分别扩增野生型等位基因和突变型等位基因。结果 :经 3 96例测定 ,发现 2例CYP2D6E与CYP2D6B的异突变型纯合子 ,其表现型均为慢代谢者。阳性对照说明本法重复性好 ,阴性对照显示本法无污染问题。结论 :本法比PCR -RFLP法更为快捷、更少污染。对CYP2D6E的测定有助于准确预测CYP2D6表现型