大肠杆菌多核苷酸磷酸化酶的快速高效纯化

利用快速蛋白质液相层析仪从大肠杆菌纯化到2500倍的多核苷酸磷酸化酶,回收率45.5％,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示为单一组分,经测定未检出RNA酶、磷酸单酯酶和5’-核苷酸酶活性。     

人CYP3A4与POR和cyt b5的三重共表达及其条件优化

目的:研究人CYP3A4与POR和cyt b5用悬浮细胞共表达时的最佳条件。方法:悬浮培养Sf 9细胞,分别摸索摇床的温度、转速、摇瓶中细胞液的量、表面活性剂的加量、细胞的培养时间,以及3种病毒的加量比例等条件,并进行优化;然后,将表达产物制成微粒体后用于睾酮的代谢,并分别测其代谢活性。结果:当恒温摇床的温度为27℃,转速为90 r/min,每250 ml摇瓶中加入80～120 ml细胞密度为5×105个/ml的细胞液,并加入0.1%的PluronicF-68,细胞培养72 h时,最适合细胞的生长和目的蛋白的表达。此时,当3种病毒的加量比例为1∶1∶1时,表达条件最佳,其对底物睾酮代谢的Km值、Vmax和CLint分别为119.6μmol/L、0.52μmol/(min.g蛋白)和4.34 ml/(min.g蛋白)。结论:通过三重共表达CYP3A4、POR、cyt b5,以及对表达条件的优化,提高了目的蛋白的表达量,得到了较高代谢活性的CYP3A4,从而为新药代谢及药物-药物相互作用研究奠定了基础,为药物代谢酶的大量表达提供了可行的方案。     

己烯雌酚人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

目的:合成己烯雌酚人工抗原,制备效价高、特异性好的己烯雌酚多克隆抗体。方法:以己烯雌酚(DES)、溴乙酸乙酯、牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)等作为合成的主要原料,采用亲核取代反应,合成己烯雌酚衍生物(DES-HS),用电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴定合成是否成功;然后,将DES-HS与BSA(OVA)偶联合成人工抗原,并用紫外扫描法以及高效液相色谱鉴定人工抗原是否制备成功。最后,用DES人工抗原动物免疫以获得DES多克隆抗体。结果:成功合成了偶联率为22∶1的己烯雌酚人工抗原。利用已合成的人工抗原制备出了效价为1∶25 600、IC50为10.81 ng/ml的己烯雌酚多克隆抗体。结论:建立了己烯雌酚人工抗原合成和鉴定以及制备己烯雌酚多克隆抗体的方法。     

宁波市国家基本药物制度试点实施情况及对策分析

通过对宁波市基本药物试点县(市、区)的基层医疗机构、配送企业、药品零售企业的实地调研,对医务人员、药品经营人员和基层患者进行访谈对话和问卷调查,运用定量分析、定性访谈、实证方法,分析试点区域内基本药物制度实施后基层医疗机构、配送流通企业的经营情况,提出增补符合本地实际情况的药品进入基本药物目录探索多渠道补助办法,完善基层医疗机构绩效考核机制,规范流通秩序,加强医保政策联动和尝试非政府主办医疗机构实施基本药物试点等对策建议.     

金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达及其生物活性研究

 目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)基因,获得重组SEE蛋白(rSEE),并对rSEE进行生物活性分析。方法通过PCR从金黄色葡萄球菌FR1326菌株基因中得到肠毒素SEE的成熟肽基因,将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化,通过MTF法研究其生物活性。结果成功构建了SEE的表达载体,并得到高纯度的重组蛋白。MTY法结果表明,rSEE具有良好的促淋巴细胞增殖的能力以及肿瘤细胞的杀伤活性。结论具超抗原活性和高纯度的rSEE,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制,构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。     

肿瘤新抗原预测方法研究进展

肿瘤新抗原是一类肿瘤特异性抗原,是潜在的肿瘤免疫治疗理想靶标。由于肿瘤新抗原产生及刺激T细胞应答的生理过程复杂,如何高效地发现与鉴定肿瘤新抗原仍是一个巨大的挑战。随着肿瘤免疫基因组学数据的积累和人工智能预测方法的深入研究,研究者能够借助人工智能新算法进行肿瘤新抗原预测方法的研究,为基于肿瘤新抗原的肿瘤免疫治疗奠定坚实的基础。本文围绕肿瘤新抗原胞内处理、抗原提呈和T细胞识别等生理过程系统综述了肿瘤新抗原预测方法的进展。     

细胞色素p450 2C19基因多态性与胃癌易感性的关系

研究细胞色素ｐ４５０ ２Ｃ１９基历多态性与胃癌易感性的关系。方法：用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法对１００例健康对照者和５０例胃癌患者进行ＣＹＰ２Ｃ１９等位基因多态性分组分析。结果：胃癌患者中ＣＹＰ２Ｃ１９ＰＭ发生率为２８．０％，较正常对照组的１４．０％高，经统计，两组间有显著性差异（χ＾２＝４．３０，Ｐ〈０．０５）。结论：ＣＹＰ２Ｃ１９ＰＭ增加了胃癌发生的危险性，实验结果提示ＣＹＰ２Ｃ１９参与了胃癌致癌物的     

ASA法和PCR-RFLP法对CYP2C19ml和CYP2C19m2等位基因分析的比较

[目的]建立等位基因特异性扩增法(ASA)检测CYP2C19ml和CYP2C19m2等位基因。[方法]用ASA法和聚合酶链反应与限制性片段长度多态性结合使用的方法(PCR-RFLP)同时检测100例随机健康受试者血样CYV2C19ml和CYV2C19m2等位基因。[结果]对100例随机健康受试者血样(CYP2C19ml和m2的检测，结果是wt／wt 45例、wt／ml 30例、wt／m2 11例、ml／m2 7例、ml／m2 7例、m2／m2 0例。[结论]ASA法简单、快速、复重性好，适用于一般实验室检查及大规模的人群调查。     

中国汉族人群S-美芬妥英4'-羟化酶的表型与基因分析

目的：研究中国汉族人群S-美芬妥英4'-羟化代谢遗传多态性。方法：以美芬妥英为探针药物采用手性毛细管气相色谱法测定尿中S-/R-MP浓度比值, 对90名志愿者进行了表型分型测定,应用PCR技术对其中的26名志愿者进行了S-美芬妥英4'-羟化酶（CYP2C19）基因分析。结果：表型分析结果,11人属慢代谢者（PM）,S/R比值0.95;基因分析结果,6人为野生型纯合子（wt/wt）;10人为杂合子（wt/m₁和wt/m₂）,9人为CYP2C19m₁突变型纯合子（m₁/m₁）,1人为两突变型杂合子（m₁/m₂）。结论：表型分析与基因分析结果显示了很好的相关性,本实验测得慢代谢者的频发率为12.2%,与文献报道相符。     

BAP-SRC-1融合蛋白的表达及其在药物代谢酶调控研究中的应用

 目的获得活性表达的细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,BAP)基因和人甾体受体辅活化因子-1(steroid recep- tor coactivator-1,SRC-1)的融合蛋白,应用于辅活化因子与核受体的结合研究。方法从Escherichia coli JM83基因组和人肝总RNA中分别扩增获得BAP基因和SRC-1的186个氨基酸对应的基因序列(简称SRC186)。用重组技术,构建BAP-SRC186- pET28a融合基因表达载体,在Escherichia coli Rosetta(DE3)中,以IPTG低温诱导表达。以对硝基苯磷酸盐(p-nitrophenyl-phos- phate,PNPP)为底物进行活性测定。活性表达的BAP-SRC186融合蛋白被应用于辅活化因子与核受体的结合研究。结果获得可溶性融合蛋白BAP-SRC186。该融合蛋白的BAP比活为(0.176±0.013 4)μmol·min^-1·mg(pro)^-1 在利福平存在的情况下,BAP-SRC186能与孕烷X受体配体结合域(pregnane X receptor ligand binding domain,PXRLBD)发生利福平剂量依赖性的相互作用,作用强度通过BAP的显色反应可方便地检测结论BAP融合蛋白与核受体的结合研究为药物代谢酶调控的体外研究开辟了新的思路。