三年来应用沙门氏菌/微粒体酶系统检测诱变剂或致癌剂小结

沙门氏菌/微粒体酶体外试验系统是一个灵敏、快速、经济、可靠的试验,用于检出环境中的诱变剂。它是利用组氨酸需要型鼠伤寒菌株,在诱变剂的作用下,使之发生回变为不需组氨酸型,从而能在最低营养培养基上长成菌落。由于鼠伤寒沙门氏菌缺乏哺乳类动物的药物代谢酶系统,故在必要时,试验中要加入哺乳动物(常用大鼠)的微粒体酶(常用肝)。在实际工作中,是应用肝匀浆9,000×g离心的上清液。其中除含微粒体膜结合酶外,还含其他的细胞内可溶性酶,如6-磷酸葡萄糖(G-6-P)脱氢酶。     

哺乳类细胞参与MNNG诱导的非定标性突变发生基因的分离和功能研究

目的:遗传不稳定是存在于人类遗传性疾病及肿瘤中的一种重要现象,也可由环境致癌性理化因子诱发,但其发生的具体机制尚不清楚。本实验室已证实了烷化剂N - 甲基- N’- 硝基- N - 亚硝基胍(MNNG) 可以诱发出vero 细胞的遗传不稳定状态,表现为延迟发生的非损伤部位DNA 突变率增加(非定标突变) ,且突变谱明显不同于由MNNG直接攻击引起的定标性突变。转录抑制剂放线菌素D 可抑制这种突变的形成,提示它的发生依存于基因表达的改变。本研究目的是分离筛选参与以非定标性突变为特征的遗传不稳定发生的相关基因。方法:利用反义核酸技术,对本实验室用差异显示方法分离得到的EST 片段进行功能分析。首先改建了两个真核表达载体的抗性,利用抗性选择使之进入细胞后不会干乱利用穿梭质粒Z189 进行非定标性突变率检测的实验系统。利用此载体构建含反向插入片段的真核细胞表达重组体并转染细胞,以获得反义RNA 阻断其相应基因的表达,再检测非定标性突变率的变化。结果:筛选得到两个EST 片段(片段9 ,片段10) ,它们相关基因的表达被阻断后,非定标突变率均发生了显著的改变。9 号片段相关基因的表达阻断后,非定标性突变率显著增高,vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp2细胞组及含正反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp29 ,自发突变率均较接近,分别为1. 6 ×10 - 4 ;4. 9 ×10 - 4 ;4. 7 ×10 - 4及4. 0 ×10 - 4 ,而MNNG处理后突变率均显著增高,分别为23. 6 ×10 - 4 ;36. 1 ×10 - 4 ;25. 0 ×10 - 4及67. 0 ×10 - 4 ,与自发突变率相比P < 0. 01 ,而其中vero2pM2amp29 - 细胞系在MNNG处理后pZ189 复制的突变率较其它各组的非定标性突变率进一步增高, P < 0. 05 ,在含反向插入片段的表达质粒的细胞vero2pM2amp210 - 中,10 号片段的相关基因表达阻断后,非定标性突变率下降至自发突变水平。vero 细胞组、含空载体的vero2pM2amp - 细胞组及vero2pM2amp210 - 细胞组,自发突变率较接近,分别为17. 2 ×10 - 4 ;4. 6 ×10 - 4及5. 2 ×10 - 4 ,在MNNG处理后,突变率分别为17. 2 ×10 - 4 ;16. 1 ×10 - 4及2. 5 ×10 - 4 ,vero2pM2amp - 10 细胞组的非定标突变率与其它组比较P < 0. 01。结论:反义核酸技术筛选到两个分离片段的相关基因与哺乳类细胞非定标性突变发生有关,其中9 号片段的相关基因可能参与维持细胞遗传稳定性,抑制非定标性突变的发生,而10 号片段的相关基因则可参与引起烷化剂处理后细胞非定标性突变的产生。     

甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定vero细胞DNA体外复制的保真度

利用在猴肾vero细胞抽提物中建立的DNA体外复制系统，对穿梭质粒pZ189 DNA进行有效的复制后，将复制产物转化至E.coli MBM7070，观察pZ189质粒DNA中突变靶基因supF tRNA基因突变的情况．在烷化剂甲基硝基亚硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine)诱发的遗传不稳定(genetic instability) vero细胞胞浆抽提物中进行pZ189质粒DNA复制, 发现经过体外复制的pZ189质粒中supF tRNA基因突变率高出对照组5-8倍(P<0.05)，证实该细胞DNA复制系统的复制保真度明显降低.     

茶多酚对人羊膜上皮细胞FL形成B（a）P－DNA加成物的影响

应用３２Ｐ后标记法检测人羊膜上皮细胞（ＦＬ）经不同浓度茶多酚（２５μｇ／ｍｌ，５０μｇ／ｍｌ和１００μｇ／ｍｌ，终浓度，下同）和β－萘黄酮（２×ｌ０－５ｍｏｌ／Ｌ）所形成的Ｂ（ａ）Ｐ－ＤＮＡ加成物，观察茶多酚化学预防作用。结果表明，茶多酚不仅可以抑制β－萘黄酮对ＦＬ细胞细胞色素Ｐ４５０同功酶的活性的诱导，减少Ｂ（ａ）Ｐ－ＤＮＡ加成物的形成；也可抑制经β－萘黄酮诱导后的ＦＬ细胞形成Ｂ（ａ）Ｐ－ＤＮＡ加成物，而且该抑制效应与茶多酚剂量一致。茶多酚的化学预防作用可能与其影响细胞色素Ｐ４５０同功酶的表达调节以及抑制其活性有关。     

含磷二硫物的细菌诱变试验

二硫物化学名为双-(0,0-二乙基硫代磷酞基)二硫物〔Bis-(0,0-diethyl phosinothioyl)-disulfide〕,是新合成的硫代磷酸醋类农用杀菌剂,对水稻白叶枯病等有较好防治效果。国内外文献中尚未见到有关该药剂的遗传毒性试验报道。我们对二     

有机磷杀菌、杀螨剂双-[0、0-二乙硫代磷酰]—二硫物诱发人培养细胞系的程序外DNA合成

真核细胞在细胞周期S期以外的DNA合成称为程序外DNA合成(UDS)。DNA损伤后的修复过程中发生的修复合成即属之。根据化学物质能否诱发UDS以推断它是否具有引起DNA损伤的能力来预测该物质的诱变性/致癌性,是一个很有价值的体外短期试验法。在国外,用于此目的的UDS检测法有两种:(1)放射自显影显示法。比较半保留复制被阻断的细胞中银粒数/核的变化来反映UDS过程中~3H-TdR的掺入量。我们曾经     

人细胞色素P4502B6在哺乳类细胞中的稳定表达

〗在诱变试验中广泛应用人羊膜ＦＬ细胞，中国仓鼠ＣＨＬ和Ｖ７９细胞，但由于它们不能表达内源性细胞色素Ｐ４５０（ＣＹＰ）活化前致突变物，而严重限制了它们的使用．本工作构建了携有编码ＣＹＰ２Ｂ６单胺氧化酶的ｃＤＮＡ重组表达体并分别导入上述三种细胞中表达，经Ｇ４１８抗性筛选，建立了ＦＬ－２Ｂ６，ＣＨＬ－２Ｂ６和Ｖ７９－２Ｂ６三种转基因细胞系，用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交证明它们都有ＣＹＰ２Ｂ６的表达．在ＣＨＬ－２Ｂ６细胞中还测得较高水平的７－乙氧基－４－三氟甲基香豆素去乙基酶活性，它对前致突变物甲基亚硝胺吡啶酮的致微核形成作用有很高敏感性，并呈剂量效应关系，但其母系细胞皆为阴性．     

生大蒜、鞣酸、肉桂醛的抗诱变作用

以E.coli wp2 trp~-和E.coli wp2 trp~-uvrA~-为靶细胞,4-硝基喹啉氧化物(4-NQO)为诱变因子,以回变菌落(Trp~ )下降为指标,观察生大蒜、鞣酸、肉桂醛抗诱变作用.实验显示上述三种化合物均能拮抗4-NQO的诱变作用,并进一步揭示大蒜拮抗4-NQO的作用可能是在细胞内,且在DNA损伤之前.实验排除了大蒜本身对试验菌的毒性、对Trp~ 的选择性毒性与生长、繁殖的影响.     

可可豆壳棕色素毒性试验及其安全评价

对可可豆壳中提炼出的天然色素进行了一系列毒性研究。在所有实验取得阴性结果的基础上,对该色素进行了安全评价。结果表明,最高剂量组大鼠平均每天摄入的色素量为1.129 mg/kg bw至1.378 mg/kg bw,各项观察指标与对照组无显著差别(P>0.05)。棕色素一般每公斤食品添加0.5～0.8 g,如果一个体重25公斤的儿童每天吃250g这种食品,则将摄入5～8 mg/kg bw棕色素。现最高剂量组两性大鼠摄入的色素超过人体摄入量的140倍以上,未发现毒作用。根据色素的全部毒性试验结果,未出现急、慢性毒性。我们认为,该棕色素作为食品添加剂是安全的,在食品加工中是一种比较经济和有发展前途的食用天然色素。