超声微泡造影剂促腺病毒转染mdr1基因的体外实验

目的 研究体外超声微泡造影剂促腺病毒转染mdr1基因的效率.方法 扩增表达mdr1基因的重组腺病毒Ad5-mdr1并与微泡造影剂混合;密度梯度离心法分选兔骨髓单个核细胞,与腺病毒微泡造影剂混合,经超声辐照后常规培养;荧光显微镜下观察细胞内荧光强度表达;RT-PCR法检测骨髓单个核细胞基因组中外源性mdr1基因的表达;免疫组织化学法检测转染细胞中mdr1基因的表达产物.结果 ①转染后b(腺病毒转染组)、c(腺病毒转染+超声辐照组)、d(腺病毒微泡造影剂转染组)及e(腺病毒微泡造影剂转染+超声辐照组)组细胞内均有绿色荧光显示,a(常规培养组)组细胞内未见绿色荧光,e组细胞内荧光强度明显高于各对照组;②RT-PCR法显示,除a组外其余4组在157bp处分别观察到特异性mdr1电泳条带,证实外源性mdr1基因通过腺病毒作为载体整合到细胞基因组中;③免疫组织化学法检测e组细胞P-gp表达阳性率(24%)显著高于a、b、c、d(阳性率分别为0.5%、8.5%、10%、11.5%)各组(P<0.05).结论 体外实验证实,超声微泡造影剂能促进以腺病毒为载体的mdr1基因转染和表达.     

血管瘤发病机制研究

血管瘤是婴幼儿时期最常见的肿瘤，绝大多数为良性，由于所观察的人群及年龄阶段不同，其发生率报道差异较大，有1％～12％，女性发病率高于男性。其发病部位最多见于皮肤和皮下组织，尤其是头颈部皮肤。其次，颅内、肝脏及深部肌肉、骨骼亦可受累，而膀胱和小肠等内脏器官则较少见。据传统形态学分类，血管瘤可分为：毛细血管瘤、海绵状血管瘤、     

腺病毒介导多药耐药基因1保护骨髓的体外实验研究

目的构建表达多药耐药基因1（MDR1）的重组腺病毒载体，体外实验研究MDR1基因对骨髓的保护作用。方法用基因工程技术将MDR1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上，利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组，然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293细胞，并在其中包装、扩增、收获病毒。进一步采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度进行检测。将收集的重组腺病毒Ad5-MDR1感染小鼠单个核细胞，通过荧光显微镜、免疫组化及流式细胞仪对感染效率及保护作用进行检测，并用Westernblot法检测P-gp的表达。结果酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功，病毒滴度达8．3×10^11pfu／ml。对小鼠单个核细胞的感染效率可达10％～15％，转染小鼠单个核细胞48h后，有P-gp蛋白的明显表达。结论成功构建了表达MDR1的重组腺病毒载体，证实MDR转染对骨髓具有保护作用。     

聚焦超声治疗儿童血管病变动物模型的实验研究

目的探讨聚焦超声治疗儿童血管病变动物模型的能效关系及安全性和有效性。方法使用CZP型超声治疗仪样机，选择合适探头焦距，调节功率和时间，对海南灰公鸡鸡冠进行扫描式辐照后，肉眼观察鸡冠及2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色实验、光镜和电镜下观察和超声多普勒检查鸡冠血管层改变。结果①海南灰公鸡鸡冠和儿童血管病变组织结构相似；②2.6w200S和3．6w120s两种剂量辐照鸡冠，作用表皮下血管层的有效率均为100％，表皮不可逆性损伤发生率分别为0、37．5％；③治疗前后两组海南灰公鸡的采食量、水消耗、体重及肛温均无明显改变（P〉0．05）。结论聚焦超声治疗血管病变动物模型的研究显示其可能成为治疗儿童皮肤皮下血管病变的安全有效的新方法之一。     

探讨MDR1基因转染k562细胞的最适条件

化疗实施中引起的肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性和化疗药物引起的骨髓抑制是化疗成功的最大障碍[1] 。本研究选用人类ｋ5 6 2细胞株作为多药耐药基因 (ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ1,ＭＤＲ1)转移的靶细胞 ,了解最适的转染方式与条件 ,为进一步将ＭＤＲ1基因转染人骨髓干祖细胞及评估其在化疗中对骨髓造血细胞保护的可行性与可靠性奠定基础。材料与方法一、实验材料质粒 ｐＨａＭＤＲ1/Ａ由美国国立癌症研究所ＭｉｃｈａｅｌＭ .Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ教授惠赠。ｋ5 6 2细胞 (人类慢性粒细胞白血病急性红白变细胞系 )由重庆…     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.     

实验性巨结肠大鼠模型的建立及其生物学特性

目的:建立一种适合骨髓间充质干细胞移植的实验性巨结肠大鼠模型并观察其生物学特性.方法:8～9周龄SD大鼠90只,随机分为两组.氯胺酮麻醉下开腹,实验组用0.1%苯扎氯铵(BAC)处理大鼠降结肠浆膜40min,温盐水冲洗后关腹,对照组用生理盐水代替BAC.分别于术后1、2、3、4、8周进行大体观察、钡灌肠,结肠测压、取处理段结肠行病理学检查,循环水浴药理学测定平滑肌收缩功能变化,RT-PCR检测AchE、nestin、Chrm3的表达.结果:BAC处理后1周,实验组大鼠出现腹胀,处理段结肠狭窄,反射性收缩消失,对乙酰胆碱敏感性增强,近端结肠扩张有大便堆积,且随着时间延长症状加重.病理学检查发现BAC处理后1周结肠神经节细胞明显减少、空泡变,3周后完全消失.结论:采用0.1?C处理降结肠浆膜成功建立了实验性巨结肠模型,此模型与先天性巨结肠动物模型相似,为进一步结肠内骨髓间充质干细胞移植移植分化为神经细胞的研究奠定了基础.     

LRP、GST-π在睾丸生殖细胞肿瘤中的表达及其意义

目的：探讨睾丸生殖细胞肿瘤中LRP（Lung resistance-related protein）、GST-π的表达及其临床意义.方法：应用SP免疫组织化学法检测41例术前未化疗的睾丸生殖细胞肿瘤标本LRP、GST-π的表达.结果：LRP总的表达率为41.5%,Ⅱ＋Ⅲ期为LRP的表达率73.3%高于Ⅰ期23.1%（P＜0.05）;LRP在精原细胞瘤中表达率为40.0%,非精原细胞生殖细胞肿瘤中的表达率为45.5%（P＞0.05）.GST-π总的表达率为34.1%,Ⅰ期表达率为38.5%,Ⅱ＋Ⅲ期表达率为26.7%,在精原细胞瘤中表达率为30.0%,在非精原细胞生殖细胞肿瘤中的表达率为45.5%,GST-π与睾丸生殖细胞肿瘤的临床分期及病理类型之间无显著差异（P＞0.05）.结论：LRP的表达与睾丸生殖细胞肿瘤的临床分期有关,可用作判断预后有价值的指标.     

不同年龄增生性瘢痕转化生长因子β1表达的检测及其意义

目的 通过观察不同年龄增生性瘢痕与正常皮肤组织中转化生长因子β1（TGF－β1）的表达初步探讨TGF－β1的表达与增生性瘢痕形成的年龄因素的关系。方法 以增生性瘢为对象，正常皮肤组织为对照，采用SABC免疫组化方法观察1－19岁，20－50岁增生性瘢痕与各年龄组正常皮肤的细胞因子TGF－β1的表达。结果 增生性瘢痕组织的TGF－β1含量显著大于正常皮肤。1－19岁增生性瘢痕组TGF－β1表达较20－50岁增生性瘢痕组的增高差异有显著性意义（P＜0．01）。胎儿皮肤TGF－β1表达低于正常皮肤（P＜0．01）。结论 TGF－β1表达增高是增生性瘢痕形成的原因之一。     

P-gp、MRP1、LRP和GST-π在卵黄囊瘤不同组织结构中的表达及临床意义

目的　探讨四种耐药基因蛋白P gp、MRP1、LRP和GST π在卵黄囊瘤组织的表达与卵黄囊瘤临床病理学特征的关系。方法　采用免疫组化SP法检测 32例卵黄囊瘤组织不同结构的P gp、MRP1、LRP和GST π的表达情况。 结果　① 32例卵黄囊瘤均可见疏松网状结构及嗜酸性透明小体 (10 0 % ) ,S D小体 2 6例 (2 6 /32 ,81.3% ) ,腺体、腺样结构 2 2例 (6 8.8% ,2 6 /32 ) ,乳头状结构 13例 (4 0 .6 % ,13/32 ) ,富于细胞的实性结构 15例 (4 6 .9% ,15 /32 ) ;②P gp、MRP1、LRP和GST π在不同的结构中表达不同 ,差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。结论　P gp、MRP1、LRP和GST π在卵黄囊瘤组织不同结构表达的差异 ,有助于临床的个体化治疗和化疗效果的预测 ,有助于临床个体化疗方案的制定和预后。