靶向大鼠CTGF的shRNA表达载体的构建和作用分析

目的:构建并筛选靶向大鼠结缔组织生长因子(CTGF)的shRNA表达载体.方法:根据大鼠CTGF mRNA序列设计并构建4个靶向大鼠CTGF基因的shRNA干扰质粒;然后以脂质体转染试剂将目的质粒转染至大鼠心肌成纤维细胞,流式细胞技术分选出成功转染的阳性细胞.通过RT-PCR和Western Blot技术对成功构建的4个shRNA干扰质粒进行有效性筛选,分析其CTGF mRNA及蛋白表达水平.结果:酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入载体,经测序证明与设计的相同;在转染成纤维细胞48 h后,与空白对照组比较,有3组细胞CTGF mRNA及蛋白表达水平明显降低;而转染非特异阴性质粒对照组CTGF mRNA及蛋白表达水平无明显变化.结论:成功构建并筛选出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表达质粒重组体,为进一步进行体内外心肌纤维化的RNA干扰研究奠定了基础.     

RNA干扰选择性下调心肌成纤维细胞结缔组织生长因子

目的 研究RNA干扰技术能否选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)及其诱导的下游纤维化成分的表达.方法 利用差速贴壁法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞.用携带U6启动子和CTGF特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体CTGF-shRNA,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒CTGF-con以lipofectamine TM2000为载体转染原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞.加入含G418的DMEM培养液培养一月筛选后获得稳定转染的细胞.通过半定量RT-PCR检测细胞内转化生长因子(TGF-β1),CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达,Western-blot法检测细胞内CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达.结果 CTGF在心肌成纤维细胞中有基础表达,并在转化生长因子β1(TGF-β1)刺激下其含量增加,CTGF-shRNA使心肌成纤维细胞CTGF的mRNA和蛋白质的表达分别降低65%和78%,FN的mRNA和蛋白质的表达分别降低81%和63%,而TGF-β1mRNA的表达上调32%.转染对照质粒组较空白对照组与脂质体组CTGF,FN表达量差异无统计学意义.结论 RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞CTGF及下游纤维化成分FN的表达,进一步为拮抗心肌纤维化的基因治疗提供了依据.     

介入封堵治疗镜面右位心合并动脉导管未闭老年患者1例

<正>1临床资料患者,女,68岁,2005年开始出现劳力性呼吸困难,伴有心悸、胸闷不适,2019年开始前述症状加重,期间患者未进行任何正规诊治措施,于2019年10月下旬入院。查体:心界向右侧扩大,心室率133次/min,节律不齐,第一心音强弱不等,胸骨旁右侧第二肋间可闻及连续性机器样杂音。     

RNA干扰选择性下调心肌成纤维细胞结缔组织生长因子

目的研究RNA干扰技术能否选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞结缔组织生长因子（CTGF）及其诱导的下游纤维化成分的表达。方法利用差速贴壁法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞。用携带U6启动子和CTGF特异性短发夹RNA（shRNA）编码序列的质粒载体CTGF-shRNA，及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒CTGF-con以lipofectamine ^TM2000为载体转染原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞。加入含G418的DMEM培养液培养一月筛选后获得稳定转染的细胞。通过半定量RT-PCR检测细胞内转化生长因子（TGF-β1），CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白（FN）的表达，Western-blot法检测细胞内CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白（FN）的表达。结果CTGF在心肌成纤维细胞中有基础表达，并在转化生长因子β1（TGF-β1）刺激下其含量增加，CTGF-shRNA使心肌成纤维细胞CTGF的mRNA和蛋白质的表达分别降低65％和78％，FN的mRNA和蛋白质的表达分别降低81％和63％，而TGF-β1mRNA的表达上调32％。转染对照质粒组较空白对照组与脂质体组CTGF，FN表达量差异无统计学意义。结论RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞CTGF及下游纤维化成分FN的表达，进一步为拮抗心肌纤维化的基因治疗提供了依据。     

吡格列酮预处理对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体ATP敏感性钾通道的影响

目的:观察吡格列酮(Pio)对在体大鼠心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体ATP敏感性钾通道影响,探讨Pio对心肌缺血损伤保护作用及其机制. 方法: 24只SD大鼠随机分为假手术组(SO组),缺血/再灌注组(I/R组),Pio预处理组(Pio组)和线粒体ATP敏感性钾通道阻滞剂5-羟基葵酸(5-HD) Pio组(5-HD Pio组)4组. 各组于缺血/再灌注前24 h尾静脉注射相应溶媒及药物,5-HD Pio组注入5-HD 10 mg/kg 30 min后再给予Pio 3 mg/kg;Pio组只注入Pio 3 mg/kg;SO组不结扎前降支,4 h后取出心脏;余三组结扎前降支30 min,再灌注4 h后取出心脏. 用透射电镜观察心肌线粒体超微结构的改变;采用TUNEL法和免疫组化法检测缺血心肌细胞凋亡和Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白的表达以及RT-PCR法测Fas mRNA的表达. 又另取18只SD大鼠随机分成SO,I/R和Pio组,行心肌梗死范围的测定. 结果:①与I/R组相比,Pio组线粒体损伤程度明显减轻;②与I/R组(34.93±5.55)%相比,Pio组(20.24±3.93)%心肌梗死范围明显减少(P＜0.05);③与I/R组相比,Pio组能明显增加Bcl-2蛋白的阳性细胞指数(P＜0.05),降低心肌细胞凋亡率(P＜0.05)及Bax, Caspase-3蛋白的阳性细胞指数(P＜0.05),下调Fas mRNA的表达水平. I/R组与5-HD Pio组相比,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论:Pio预处理可通过保护心肌线粒体结构,减少心肌细胞凋亡及梗死范围,保护缺血心肌损伤作用可被线粒体ATP敏感性钾通道阻滞剂所对抗.     

RNA干扰选择性下调血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的表达

目的:从血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的基础分泌及转化生长因子β1对其分泌的诱导作用入手,进一步观察并验证RNA干扰技术靶向抑制结缔组织生长因子对下游纤维化因子的影响。方法:实验于2006-03/2007-05在武汉协和医院心血管病研究所实验室完成。①实验材料:健康雄性成年SD大鼠,体质量150～180g。②实验方法及分组:分离培养成年大鼠血管平滑肌细胞,以5μg/L终浓度转化生长因子β1对培养的血管平滑肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠结缔组织生长因子的shRNA干扰质粒转染入血管平滑肌细胞,200mg/L终浓度的G418筛选出稳定转染细胞株后培养增殖进入后续实验。将实验分为5组,分别为对照组,不给与任何干预措施;转化生长因子β1刺激组,在培养的血管平滑肌细胞培养液中加入转化生长因子β1(5μg/L终浓度)刺激诱导24h;HK阴性质粒对照组,血管平滑肌细胞常规培养3～5代后转染HK阴性质粒继续培养48h;RNA干扰组,先以转化生长因子β1(5μg/L终浓度)诱导刺激血管平滑肌细胞24h后再转染干扰质粒继续培养48h;单纯转染试剂组,细胞常规培养3～5代后仅加入lipo2000转染试剂。③实验评估:通过逆转录-聚合酶链反应和(或)蛋白免疫印迹技术进一步检测各组心肌细胞结缔组织生长因子、纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达。结果:①组织块贴附法培养的原代血管平滑肌细胞,可见大量细胞紧密排列成长梭形。②倒置荧光显微镜下观察,脂质体lipo2000转染血管平滑肌细胞瞬时转染效率仅有大约30%左右;而通过加入G418进行稳定转染后,几乎所有细胞均可被激发出亮绿色荧光,转染效率可达95%以上。③对照组结缔组织生长因子、纤维连接蛋白均有低水平的基础分泌,在予以转化生长因子β1诱导后表达显著升高(P<0.01);而在靶向特异性RNA干扰后,与转化生长因子β1刺激组比较,结缔组织生长因子及纤维连接蛋白的表达均被显著抑制(P<0.01);并且纤维化因子纤维连接蛋白及胶原的表达与促纤维化因子结缔组织生长因子的表达有显著相关性。结论:血管平滑肌细胞可自主分泌结缔组织生长因子及细胞外基质成分;而通过RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子后可阻抑血管平滑肌细胞分泌下游纤维化因子。提示血管平滑肌细胞可主动参与心血管重塑及纤维化,而RNA干扰靶向沉默结缔组织生长因子基因的表达可以有效干预纤维化过程。     

Calpain抑制剂降低高糖诱导的心肌细胞凋亡的机制

目的:探讨calpain抑制剂降低高糖诱导的心肌细胞凋亡的机制。方法:分离培养SD乳鼠心肌细胞,实验分为3组:对照组、高糖组(35mmol/L)、高糖(35mmol/L)+calpain抑制剂(ALLN)(25mmol/L)组。MTT测定各组心肌细胞的生长活力,激光共聚焦显微镜观察和检测心肌细胞线粒体通透性和膜电位,Westernblot法检测激活型半胱天冬酶(caspase)-3蛋白的表达。结果:高糖组心肌细胞生存率为(55±11)%;高糖+ALLN组心肌细胞生存率为(70±15)%,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。高糖可以刺激心肌细胞线粒体通透性增加,线粒体膜通道孔开放,而ALLN预处理可以抑制高糖对心肌细胞的这种作用[相对荧光强度:(30±15)%∶(60±11)%,P<0.05]。高糖可以降低心肌细胞线粒体膜电位,而ALLN预处理可以抑制高糖对心肌细胞的这种作用[相对荧光强度:(22±12)%∶(80±19)%,P<0.05]。高糖刺激可以导致心肌细胞激活型caspase-3的表达增加,而加入ALLN预处理后可以抑制激活型caspase-3的表达,2组比较差异有统计学意义[(0.42±0.11)∶(0.21±0.12),P<0.05]。结论:Calpain抑制剂有降低高糖诱导的心肌细胞凋亡的保护效应,其机制可能涉及多方面。     

结缔组织生长因子在心血管疾病的作用及研究进展

结缔组织生长因子是一种新发现的可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积的生长因子,结缔组织生长因子具有广泛的生物学功能如促纤维化、促有丝分裂、趋化作用、促细胞增殖,诱导凋亡以及促血管新生等。结缔组织生长因子在多种细胞均可表达,在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化病变,心肌梗死以及心肌炎等各种心血管疾病中结缔组织生长因子表达均明显增高,并可能通过其多种生物学行为参与心血管重塑、心脏纤维化和动脉粥样硬化病变的发生发展。     

冠状动脉介入治疗对冠心病血浆心肌肌钙蛋白T的影响

目的：探讨冠状动脉介入治疗对冠心病血浆心肌肌钙蛋白T的影响。方法：随机抽取我院2013年2月～2015年2月收治的90例冠心病患者为研究对象,其中45例经冠状动脉介入治疗患者为观察组,45例冠状动脉造影呈阳性但未经冠状动脉介入治疗的患者为对照组,应用发光免疫法检测、比较两组患者手术前后心肌肌钙蛋白T(cTnT)的水平变化并找出潜在的影响因素。结果：两组组内术前、术后比较：观察组cTnT术后显著上升,对照组无明显变化;两组组间比较：观察组术后cTnT值显著高于对照组,差异比较具有统计学意义。结论：冠状动脉介入治疗对冠心病血浆心肌肌钙蛋白T存在一定影响,术后cTnT值上升,表明心肌出现一定程度损伤或血管内皮损伤,冠状动脉介入治疗能导致血浆心肌肌钙蛋白T的释放。