大鼠内皮祖细胞的培养及鉴定

目的 探索大鼠内皮祖细胞的分离培养,为缺血性疾病细胞移植治疗提供实验方法.方法 采集大鼠骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液M199培养基培养(含20%FCS+15 ng/ml VEGF),种植于提前包埋了纤维连接蛋白的六孔板培养,应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133.并通过检测其对FITC标记的UED-1的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定.结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133.大鼠骨髓单个核细胞经体外诱导分化,培养第5～14天的贴壁细胞不同程度的表达CD34、CD133、Flk-1和CD31.培养第9天流式细胞仪检测其阳性率分别为(40.12±6.28)%、(15.62±4.31)%、(44.05±8.20)%和(76.1±7.20)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,并且在Matrigel上可以形成毛细血管样.结论 大鼠骨髓可以分离培养内皮祖细胞并能体外扩增,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.     

用细胞内细胞因子染色方法检测HLA-A*02个体CD8+T细胞的免疫应答

目的 :用细胞内细胞因子染色方法 (ICCS)检测不同HLA A 0 2个体的CD8+ T细胞对流感病毒多肽的免疫应答状况。方法 :采用SSP法确定HLA A 0 2亚型 ;分离HLA A 0 2个体的外周血单个核细胞 (PBMC) ,与流感病毒特异的HLA A 0 2 0 1限制性CTL表位多肽 (IMP5 8 6 6 ,GILGFVFTL)孵育 ,ICCS检测CD8+ T细胞分泌细胞因子IFN γ、IL 2和TNF α。结果 :发现HLA A 0 2不同亚型的人PBMC对流感病毒多肽均具有记忆性免疫应答。结论 :①ICCS方法可特异性定量检测T细胞活化状态 ;②HLA A 0 2人群中普遍存在对IMP5 8 6 6多肽的记忆性免疫应答 ;③对于HLA A 0 2 0 1限制性多肽 ,与其它不同HLA A 0 2亚型间存在交叉反应性。     

乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法　以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果　成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论　获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。     

乙型肝炎病毒rtA181V/T和rtN236T变异阿德福韦耐药株表达质粒的构建及其病毒学特征

目的构建乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异株（rtA181T／V和rtN236T）表达载体并对其体外复制能力和耐药性等病毒学特征进行体外研究。方法以含1．2倍拷贝HBV DNA全基因的质粒PUC-HBV1．2WT为模板，PCR定点诱变技术构建含阿德福韦耐药株（rtA181V／T和rtN236T）的目的质粒，测序验证并利用变异株特异检测引物进行PCR检测；转染人肝癌细胞系HepG2，ELISA检测上清中分泌的HBsAg和HBeAg水平，荧光定量PCR检测上清中病毒DNA水平，Southern blotting检测胞浆HBV复制中间体水平，比较野生株和变异株体外复制能力和对阿德福韦敏感性的差异。结果构建的rtA181T、rtA181V和rtN236T表达质粒可用于变异株特异检测引物检测相应变异的阳性对照品；转染HepG2细胞后均可获得高水平的病毒抗原表达，胞浆和细胞培养上清中可以检测到HBV复制中间体和病毒颗粒的存在；三种变异均可单独导致对阿德福韦耐药，IC50为野生株的2．8至4．7倍；体外复制能力较野生株降低，分别为野生株的94．2％、89．0％和77．7％。结论成功构建乙型肝炎病毒阿德福韦变异株表达质粒并应用于变异株特异引物扩增检测技术，体外实验证实rtA181V／T和rtN236T单独变异均可导致HBV对阿德福韦耐药，且变异株的病毒复制能力较野生株有所下降。     

NY-ESO-1和MAGE-A3抗原肽诱导肝癌患者的免疫应答研究

目的利用合成的HLA-A02限制性NY—ESO-1 p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽,体外通过抗原递呈细胞诱导HCC患者外周血T淋巴细胞,从而成功诱导出特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。方法通过SSP方法筛选20例HLA—A＊02的HCC患者的HLA亚型;通过逆转录多聚酶链反应和测序分析NY—ESO-1和MAGE—A3在肝癌组织中的表达以及多肽表位密集区的核苷酸变异状况;体外用细胞因子培养HCC患者外周血来源的树突状细胞（DC）;人工合成HLA—A＊02限制性NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3 p271—279多肽,直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外同T淋巴细胞孵育16d后,利用Elispot、细胞内细胞因子染色和四聚体实验检测T细胞免疫应答。结果20例HLA—A＊02患者中,NY-ESO-1mRNA阳性患者为11例,MAGE—A3mRNA阳性患者12例。中国HCC患者表达的NY—ESO-1和MAGE—A3序列高度保守。经多肽直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外活化外周血T淋巴细胞,4例（36．4％）NY—ESO-1阳性HCC患者以及4例（33．3％）MAGE．A3患者产生针对多肽特异性的CD8’T细胞免疫应答。不同HLA—A＊02亚型HCC患者可产生针对NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽的免疫应答。结论NY—ESO-1p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以诱导出针对抗原肽的特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。提示HLA—A＊02限制性的NY-ESO-1 p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以作为有潜力的肝癌免疫治疗疫苗。     

用流式细胞仪富集大鼠骨髓干细胞

目的：建立大鼠骨髓干细胞富集的方法。方法：用常规方法从大鼠胫骨中获取骨髓细胞，采用红细胞裂解液去除红细胞，然后以PE标记的CD3、CD45RA抗体及FITC标记的Thy抗体标记细胞，最后通过流式细胞仪检测并分选Thy CD3^- CD45RA^ 细胞。结果：①大鼠骨髓细胞中CD3^ 、CD45RA^ 和Thy^ 细胞分别约占14．1％、4．2％和20．8％；②流式细胞仪分选的Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞约占2．8％。结论：应用红细胞裂解液去除红细胞及通过流式细胞仪分离Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞是一种较有效的富集大鼠骨髓干细胞的方法。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞亚群相对数量特点的分析

目的分析慢性乙型病毒性肝炎患者外周血树突状细胞亚群（DC1和DC2）相对数量特点。方法采集健康人和慢性乙型肝炎患者外周静脉抗凝全血,利用荧光抗体标记和流式细胞仪检测外周血树突状细胞亚群,DC1的特异性标记为Lineage^-HLA-DR^＋CD11c^＋,DC2的特异性标记为Lineage^-HLA-DR^＋CD123^＋;电化学发光检测血清乙型肝炎病毒标志。结果慢性乙型肝炎患者外周血DC2相对数量高于健康人近两倍,但缺少统计学意义,DC1相对数量在两者间没有差别;血清HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者外周血DC2相对数量显著增高（P=0．002）,差异存在于与HBeAg阳性患者和健康人比较中（分别D1.2=129,P〈0．01;D2．3=108,P〈0．05）,而在上述3组中DC1相对数量无差异（P=0．183）。结论慢性乙型肝炎患者外周血DC2增加与HBeAg血清转换有关,提示DC2可能有抑制病毒的作用。     

内皮祖细胞移植对大鼠肝硬化作用的研究

目的 探讨内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)移植对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的大鼠肝硬化的作用.方法 本组38只SD大鼠中8只大鼠为正常对照,其余30只采用25%的CCl4/橄榄油灌胃制备肝硬化模型.再将肝硬化大鼠分为3组,每组10只.12周后直接处死的为肝硬化模型组,门静脉输入大鼠EPCs为EPCs移植组,经门脉输入生理盐水为移植对照组.移植4周后检测移植组和移植对照组大鼠肝组织胶原Ⅲ(collagen Ⅲ,COL Ⅲ)、平滑肌动蛋白(smooth muscle actin α,α-SMA)和Ki67的表达,检测外周血肝功能和血凝分析.结果 肝硬化模型组大鼠肝脏体积增至正常时的2倍.EPCs移植组大鼠与肝硬化模型组比较,肝组织学活动指数(histological activity index,HAI)(F=75.062,P<0.01),丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)(F=29.942,P<0.05),门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)(F=16.618,P<0.05)和总胆红素(total bilirubin,TBIL)(F=9.911,P<0.05)水平降低,白蛋白(albumin,Alb)(F=4.944,P<0.05)和Ki67(F=45.966,P<0.01)水平升高,纤维化面积(F=25.025,P<0.05)减少,α-SMA(F=7.86,P<0.05)和COL Ⅲ(F=135.787,P<0.01)表达降低;与正常肝脏相比,移植对照组HAI,ALT,AST和TBIL水平升高,Alb和Ki67水平降低,纤维化面积增加,α-SMA和COL Ⅲ表达升高(P<0.05).移植对照组大鼠凝血酶原时间延长,差异有统计学意义(P<0.05). 结论移植EPCs可以促进大鼠肝硬化的肝细胞增生,减轻肝纤维化程度.     

全国多中心临床试验样本收集与冷链运输的质量调查

摘要：目的：调查一项全国多中心临床研究的样本质量及影响因素,为提高临床研究样本质量提供思路。 方法：中心实验室在集中处理样本过程中,针对样本（8 973份）和样本运输（169批次）中与标准操作程序（SOP）不符的质量问题发出疑问表,通过沟通解决疑问,总结、分析相关数据用以调查样本和样本运输质量及其影响因素。 结果：17.2%（1 539/8 973）样本存在质量问题,以“标注缺失”为主,占不合格样本总量的83.6%（1 287/1 539）,其次为“标注错误”（11.1%,171/1 539）和“样本缺失或量不足”（5.3%,81/1 539）。样本质量有较大的地域差异,且与研究中心的入组患者数量和人员配备、实验室条件无关。首次收到疑问表便能主动答复的中心,不合格样本比例由之前的15.8%（648/4 113）降至1.6%（18/1 161）;对不能主动答复疑问表的中心进行SOP再培训,不合格样本比例由27.0%（747/2 772）降至13.6%（126/927）。样本质量问题最终100%（1 539/1 539）解决。样本冷链运输中,11.2 %（19/169）批次温度异常,4.1%（7/169）批次温控记录缺失。 结论：样本质量问题以“标注缺失”为主,对后续检测影响较大的“标注错误”少见;跟踪疑问表并采取质控措施可提高样本质量;需加强样本冷链运输实时温度监控以提高样本运输质量。     

黏膜佐剂在黏膜耐受治疗大鼠实验性结肠炎中的作用

目的探讨％11样受体（TLR）参与黏膜佐剂增强黏膜耐受和缓解实验性结肠炎的可能机制。方法建立大鼠三硝基苯磺酸实验性结肠炎模型。以卵白蛋白为诱导抗原，脂多糖为佐剂，将已建立的三硝基苯磺酸结肠炎大鼠模型根据不同的干预方法分为结肠炎组（无干预）、口服耐受组、经鼻耐受组、口服加佐剂组、经鼻加佐剂组、佐剂对照组和空白对照组。用免疫组织化学方法检测各组大鼠结肠组织局部TLR2和TLR4表达水平。用三色流式细胞技术检测各组大鼠外周血调节性T细胞CD4^＋CD25^＋亚群和CD8^＋CD28^-亚群表面TLR2和TLR4表达水平。结果在结肠组织局部，结肠炎组的TLR2和TLR4阳性细胞数均显著高于正常对照组（P〈0．05）；佐剂对照组和口服加佐剂组的TLR4表达较结肠炎组显著下降（P〈0．05）。外周血CD4^＋CD25^＋亚群内，口服加佐剂组、经鼻耐受组、经鼻加佐剂组和佐剂对照组的TLR2^＋细胞比例显著低于结肠炎组（P〈0．05，P〈0．01）；口服加佐剂组和经鼻加佐剂组的TLR4^＋细胞比例显著低于结肠炎组（P〈0．05）。外周血CD4^＋CD28^-亚群内，各组的TLR2^＋细胞比例差异均无显著性；口服加佐剂组和经鼻耐受组的TLR4^＋细胞比例显著低于结肠炎组（P〈0．05）。结论多次给予脂多糖佐剂可能通过下调调节性T细胞的TLR2和TLR4表达而增强黏膜局部和循环的调节性T细胞功能（对CD4^＋CD25^＋亚群作用更明显），从而增强免疫耐受的效果。