人T-bet基因的表达、纯化及其免疫原性分析

目的：利用载体pQE30在大肠埃希菌（M15）原核表达人T-bet基因全长序列，并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体。方法：利用PCR技术从克隆载体pGEM-T／T-bet获得人T-bet的全长编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体pQE30，形成重组表达质粒pT-bet；酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109，测序鉴定后转化M15，经IPTG370C诱导4h后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白（表达产物），用Ni^2＋ -IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化；将纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠，制备人T-bet的多克隆抗体。结果：成功表达和纯化了人T-bet，并制备了多克隆抗体，ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价（1：100000）和高度特异性。结论：成功构建了原核表达载体pT-bet，并在工程菌M15中获得大量表达，经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白，制备了效价和特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础。     

胸腺抑肽对大鼠异基因心肺联合移植的影响

胸腺抑肽是从牛胸腺中提取的具有免疫抑制作用的多肽，为了进一步探讨其免疫抑制机理及应用于临床治疗移植排斥反应的可能性，我们采用了大鼠心肺联合移植术，研究了其抗移植排斥反应的作用和可能机理，现报告如下。１材料与方法１．１药物和试剂胸腺抑肽２．６ｍｇ／ｍｌ...     

nuocytes相关因子在规律血液透析治疗2型糖尿病肾病患者中的免疫学意义

目的以nuocytes相关因子为切入点,探讨2型糖尿病肾病发展及并发症形成可能的免疫学机制。方法选取2013年11月至2015年1月在江苏大学附属人民医院人工肾规律血液透析治疗的糖尿病肾病患者30例(K_0组),该院同期门诊健康体检人员30例作健康对照组(N_0组),Ficoll-泛影葡胺密度离心法分离外周血单个核细胞;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测60例受试对象外周血单个核细胞(PBMC)中nuocytes相关的视黄酸受体相关孤核受体α(RORα)、白细胞介素-17受体B(IL-17RB)、IL-33受体T_1/ST_2、细胞因子白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-13(IL-13)的mRNA水平;同时对Th1/Th2特征性细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4),转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达水平进行检测。所有入选对象随访6个月。结果随访期间K_0组中9例男性患者因呼吸道感染性疾病住院,设为K_1组,未发现其他新出现的并发症,其他未出现呼吸道感染性疾病的21例设为K_2组,在N_0组中选择与其年龄、性别相比配的健康体检者作为N_1组。与N_0组比较,K0组患者PBMC中IL-5mRNA表达水平升高(P0.05),其余因子mRNA表达水平两组比较差异均无统计学意义(P0.05)。K_1组与N_1组相比,相关孤体受体α(RORα)、IL-17RB、T_1/ST_2、IL-5、IL-13、IL-4mRNA表达水平较高,T-bet mRNA表达水平较低;K_1组与K_2组相比,RORα、IL-17RB、IL-13及GATA3mRNA表达水平升高。结论规律血液透析治疗的糖尿病肾病患者体内存在慢性致敏状态;nuocytes极化状态的出现和进展可能参与了规律血液透析治疗的糖尿病肾病男性患者呼吸道感染性疾病的发生。     

鲍曼不动杆菌OmpA经ROS/NLRP3信号通路调控THP 1细胞自噬和凋亡

目的: 探讨鲍曼不动杆菌外膜蛋白A(outer membrance protein A, OmpA)对人单核巨噬THP-1细胞自噬和凋亡的影响及其可能机制。方法: 构建OmpA/pET-28a载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3)表达纯化重组OmpA蛋白,并免疫家兔制备多克隆抗体;采用蛋白质印迹法检测呼吸机相关性肺炎患者发病前后血清中OmpA抗体水平变化。以不同浓度(1、10 μg/mL)重组OmpA蛋白分别刺激THP-1细胞1、3、6 h,采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC-3和Beclin-1表达,流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧产生,荧光实时定量PCR检测细胞含NLR家族Pyrin域NOD样受体家族3(NLRP3)、Caspase-1和IL-1β等mRNA表达。结果： 自制多抗可以识别临床菌株OmpA蛋白。呼吸机相关性肺炎患者发病前后,血清中均可检出OmpA抗体(IgG型),且发病后OmpA抗体水平显著高于气管插管前(P<0.05)。重组OmpA蛋白刺激THP-1细胞后,细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达显著上升,细胞凋亡率显著升高,呈一定的时间和浓度依赖性(P<0.05)。与对照组比,在重组OmpA蛋白作用1 h时,细胞IL-1β mRNA表达和活性氧含量显著增加(P<0.05);3 h和6 h时,3种mRNA表达量和活性氧含量显著降低(P<0.05)。结论： OmpA通过激活THP-1细胞NLRP3炎症小体,释放活性氧和IL-1β等炎症介质,诱导THP-1细胞自噬和凋亡发生。     

气相色谱-质谱联用法检测粪便中短链脂肪酸

摘要：目的：建立气相色谱-质谱联用快速检测粪便中短链脂肪酸的方法,并探讨将其应用于肠道疾病辅助诊断的可能性。 方法：分别取健康C57BL/6小鼠、SD大鼠和成年人志愿者粪便,以及用硫酸葡聚糖溶液诱导的肠炎模型C57BL/6小鼠的粪便;用气相色谱-质谱联用法检测上述标本中短链脂肪酸的种类和相对丰度。 结果：所有标本均检测出多种短链脂肪酸,其种类主要有乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。在生理条件下,人与鼠短链脂肪酸的种类和相对丰度比都十分相似。肠炎可使粪便中除乙酸外的其他短链脂肪酸的相对丰度下降,其中,尤以丁酸下降最为明显。 结论：气相色谱-质谱联用法可快速检测粪便中的短链脂肪酸,并有可能应用于肠炎等肠道疾病的辅助诊断。     

脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞体外B细胞分化条件研究

目的:研究体外脐血造血干/祖细胞向B细胞分化的条件.方法:体外免疫磁珠分离纯化脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞;在小鼠S-17基质细胞支持下,脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞、T3、各种细胞因子共培养建立体外B细胞分化发育培养体系,诱导脐血CD34+CD19-造血干/祖细胞向B细胞分化;用流式细胞仪检测培养的B细胞.结果:T3、IL-7与小鼠S-17基质细胞共培养诱导CD34+CD19-造血干/祖细胞28天时,分化形成的B细胞数可达初始培养细胞的198倍,诱导细胞大部分表达CD10、CD19.结论:在选用的实验条件下,T3、IL-7与小鼠S-17基质细胞体外能诱导脐血造血干/祖细胞的B细胞分化.     

宫颈癌患者外周血和癌组织中TH17细胞水平的变化及其临床意义

目的检测宫颈癌患者外周血单个核细胞(PBMC)和癌组织中TH17细胞(CD3+CD8-IL-17+)的比例并分析其转录因子的表达水平,探讨TH17细胞在宫颈癌发展进程中的作用。方法收集42例宫颈癌患者外周血和癌组织标本,15例体检健康者外周血标本及15例正常宫颈组织标本。用流式细胞术检测PBMC和癌组织中TH17细胞的比例以及PBMC中CCR5、CCR6、CXCR4水平。用实时荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)技术测定癌组织标本中RANTES、CXCL12和CCL20的mRNA表达水平。结果与对照组比较,宫颈癌患者外周血和癌组织中TH17细胞比例均升高(P<0.01和P<0.05),尤以宫颈癌晚期为著。宫颈癌患者PBMC中TH17细胞表面CCR6显著升高(P<0.01)。癌组织中CCL20 mRNA水平亦升高(P<0.05),RANTES、CXCL12水平无显著差异(P>0.05)。结论宫颈癌患者外周血和癌组织存在高TH17细胞水平,且随病程的进展呈现强势表达状态,监测TH17细胞水平及其特异性转录因子表达状态,有助于病程的判断。     

磁场对小鼠肿瘤生长的影响

本文研究了低频交变磁场和稳恒磁场对小鼠致癌的影响。实验结果表明，磁场强度为15mT的50Hz交变磁场和80mT的稳恒磁场均能提高机体的免疫功能；对肿瘤组织的供血情况有明显抑制效果，且磁场使肿瘤组织内形成较丰富的间质纤维；使肿瘤细胞坏死明显增多。     

牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。     

抗大鼠树突状细胞单克隆抗体的研制及初步鉴定

树突状细胞是一种重要的抗原提呈细胞,在移植排斥反应中发挥重要作用。为了进一步研究该细胞的功能和寻找抗移植排斥反应的更有效途径,我们在分离大鼠树突状细胞获得成功的基础上,应用杂交瘤技术制备出5株抗树突状细胞单克隆抗体,分别命名为WZD1～5。杂交瘤细胞培养上清或腹水对新鲜分离的大鼠树突状细胞均显示不同程度的细胞毒性作用,且与腹腔Mφ及淋巴细胞无明显交叉反应。经间接免疫荧光染色测定,腹水中单抗的效价为2×10~(-2)。