无血清培养对人绒毛膜来源间充质干细胞免疫活性的影响

目的 评价人绒毛膜来源间充质干细胞(MSCs)在无血清培养体系中的免疫活性,探索干细胞安全的应用于临床的条件.方法 应用无血清与含10％胎牛血清培养基培养人绒毛膜来源MSCs,比较两种培养条件下培养细胞的形态、免疫表型、分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用等生物学特性.结果 两种方法培养的细胞形态相似,表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、人类白细胞抗原(HLA)-DR;具有多向分化潜能,同样能明显抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,抑制率与加入的干细胞数量成正比,可以减少混合淋巴细胞反应中白细胞介素2、γ-干扰素的分泌.结论 人绒毛膜来源间充质干细胞经无血清培养后仍保持原有的细胞形态、免疫表型、多向分化等生物学特性,没有改变免疫学活性.无血清培养可取代有血清培养用于细胞培养,避免经有血清培养的干细胞移植等临床应用研究引起的免疫原性反应及人畜共患病.     

体外培养表皮干细胞复合高分子支架原位修复深度烧伤创面的研究

目的探讨表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架体内培养,对Ⅲ度烧伤创面的修复和再生作用。方法（1）表皮干细胞的培养和表征：采用快速贴壁法分离和培养表皮干细胞（Epidermal Stem Cell,ESC）。将表皮干细胞分别在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的和未经修饰的培养瓶中,或通过悬浮法培养,研究表皮干细胞的生长特性;以β1整合素和细胞角蛋白CK19免疫荧光染色实验考察细胞表型。（2）活性支架的体外构建和对大鼠Ⅲ度创面的修复作用研究：体外构建成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架;采取同体对照法,在20只Sprague—Dawley大鼠（sD大鼠）背部制作两个Ⅲ度切痂创面。左侧创面采用体外培养的自体表皮干细胞联合成纤维细胞一丝素蛋白纳米纤维活性支架移植入创面,作为组织工程移植物组;右侧创面采用凡士林纱布敷料覆盖,作为凡士林纱布敷料组。考察组织工程移植物对大鼠Ⅲ度创面的愈合作用。结果以快速贴壁法能够有效地分离得到表皮干细胞,细胞在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的培养瓶中生长10d后融合,数目达到5．1×10^5／cm^2。免疫荧光实验表明细胞表面抗原呈β1整合素和角蛋白免疫CK19成阳性,证明分离得到的细胞为表皮干细胞。成纤维细胞能够在丝素蛋白纳米纤维中扩增并分泌细胞外基质,14d后与丝素蛋白纳米纤维形成活性支架。对大鼠Ⅲ度烧伤创面的修复实验表明,组织工程移植物组的创面在第14天和第22天的平均愈合效率为66％和93％,高于凡士林纱布敷料组（32％和69％）,P〈0．05。组织工程移植物组的创面平均愈合天数为21d,低于凡士林纱布敷料组（31d）,P〈0．05。结论通过Ⅳ型胶原蛋白黏附法,能够分离得到表皮干细胞,并且其在Ⅳ型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中的生长活力较高。大鼠Ⅲ度创面的修复实验表明,组织工程移植物,即表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维支架,能够修复Ⅲ度创面,再生皮肤表真皮结构完整;并且与凡士林纱布敷料相比,能够提高创面的愈合效率,减少创面的愈合时间。     

脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化

背景:体外培养条件下脐血间充质干细胞可向神经样细胞诱导分化.一定浓度范围的脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子联合体外诱导可获得较高的神经元分化比例.目的:观察脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞分化成神经样细胞的可行性.方法:取第5代的脐血间充质干细胞,分别用5,10,20 μJ/L的脑源性神经营养因子和5,10,20 μg/L.睫状神经营养因子单独或联合诱导脐血源间充质干细胞向神经样细胞分化,另设空白对照组无任何干预措施.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1,3,6天分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色,并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例.结果与结论:①向神经细胞诱导后,人脐血源间充质干细胞形态明显改变,胞体收缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构.②与空白对照组相比,脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子能显著提高人脐血源间充质干细胞分化为神经元的比例.其中20 μg/L.的脑源性神经营养因子联合20 μg/t.睫状神经营养因子诱导人脐血源间充质干细胞分化为神经样细胞的比例最高.提示人脐血间充质干细胞经脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子体外诱导,均能够分化为神经样细胞.     

转化生长因子β3诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景: 转化生长因子β是一族多肽类生长因子,胚胎形成期可诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨组织,有研究报道转化生长因子β3和碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞的代谢和增殖.目的: 验证转化生长因子β3体外诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的可行性.方法: 骨髓来源于髋关节手术时的松质骨碎片或于下肢骨开放性手术时收集,分离培养骨髓间充质干细胞,鉴定其表面抗原,用含体积分数10%胎牛血清以及10μg/L转化生长因子β3的条件培养基诱导,诱导后细胞通过软骨细胞特征性染色,即甲苯氨蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定.结果与结论: 骨髓间充质干细胞表面抗原CD73,CD90,CD105阳性,CD14,CD34,CD45,CD106以及HLA-DR阴性.诱导后细胞形态明显改变,甲苯氨蓝以及Ⅱ型胶原染色结果阳性.提示骨髓间充质干细胞在转化生长因子β3作用下,体外可分化为软骨细胞,可以作为组织工程种子细胞的一种有效来源.     

体外诱导羊膜来源间充质干细胞分化为血管内皮细胞

背景：羊膜来源间充质干细胞植入机体不同类型组织后是否可以分化为相应组织靶细胞呢？ 目的：检测血管内皮细胞生长因子在体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 方法：分离培养羊膜间充质干细胞,鉴定其表面抗原表达,用含体积分数2%胎牛血清以及50 μg/L血管内皮生长因子的条件培养基诱导,诱导后细胞通过内皮细胞标志物血管内皮生长因子受体2以及v-WF染色鉴定。 结果与结论：羊膜间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变,内皮细胞标志物血管内皮细胞生长因子受体2以及v-WF染色结果阳性。提示羊膜间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力。     

骨髓间充质干细胞自体移植促进兔缺血肢体的血管生成

背景:常规药物治疗、介入或血管旁路移植手术对下肢动脉闭塞症的远期疗效均不理想。近年来采用干细胞的血管再生疗法在梗死部位修复或重新建立有效侧支循环逐渐成为可能。目的:验证骨髓间充质干细胞自体移植对兔缺血后肢血管再生的促进作用。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-08/2006-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。材料:选用新西兰大白兔8只,制备兔后肢缺血模型。按随机数字表法分为2组,实验组及对照组各4只。方法:分离培养实验组兔骨髓间充质干细胞,5-溴-2-脱氧尿苷标记,将骨髓间充质干细胞制成悬液注射于实验组兔后肢缺血部位;对照组注射等量生理盐水。主要观察指标:2周后行兔股动脉二维及彩色多普勒超声检测,观察移植前后的血管内径、血流峰值速度及血流加速时间等;取缺血部位肌肉组织,通过免疫荧光及苏木精-伊红染色观察移植细胞分布及血管生成情况。结果:细胞移植2周后实验组兔的股动脉内径、血流峰值速度均大于对照组(P<0.01),血流加速时间短于对照组(P<0.01)。免疫荧光染色结果显示实验组兔移植部位有抗5-溴-2-脱氧尿苷染色阳性细胞存在;苏木精-伊红染色结果显示实验组缺血部位血管密度高于对照组。结论:骨髓间充质干细胞具有促进血管生成的作用,自体移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法。     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用

目的 探索全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞过程中的作用.方法 应用Ficoll分离骨髓中单核细胞,贴壁培养,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含ATRA、bFGF、EGF的条件培养基对培养的细胞向神经细胞诱导分化;采用免疫荧光染色法对分化的细胞进行鉴定.结果 分离培养的贴壁细胞具有典型的BMSCs形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP) .结论 ATRA联合细胞因子具有诱导BMSCs在体外分化为神经元样细胞的能力.     

人脐血源性间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定

目的 建立体外培养、扩增人脐带血间充质干细胞(MSCs)的方法．初步鉴定其生物学特性。方法 无菌条件下取正常足月剖宫产的脐带血,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞．以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细咆层,测定MSCs的生长曲线．用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞存体外用合适的培养基培养,细胞贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞。间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105。但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。这与源于骨髓的MSCs一致。结论 脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够为实验和临床的应用提供一种新的间充质干细胞来源。