多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测耐异烟肼结核分枝杆菌

目的　建立耐异烟肼 (isoniazid ,INH )结核分枝杆菌多重聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (multiple polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,multi PCR SSCP)方法 ,快速、特异地同时检出aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况 ,用于快速诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性。方法　根据结核分枝杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列 ,分别设计出 3对特异性寡聚核苷酸引物 ,采用multi PCR及SSCP技术 ,同时检测对结核分枝杆菌耐INH起作用的这 3个基因的突变情况。结果　对H3 7Rv标准株、临床分离INH敏感株 (2 3株 )及INH耐药株 (3 5株 )分别采用常规PCR和multi PCR同时进行扩增 ,两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段 ,且结果符合率达10 0 % ;采用单基因PCR SSCP ,aphC启动子序列突变检出率 17% (6/3 5)、inhA序列突变检出率 2 0 % (7/3 5)、katG序列突变检出率 66% (2 3 /3 5) ;multi PCR SSCP突变检出率 83 % (2 9/3 5)。结论　耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,multi PCR SSCP方法敏感、特异 ,能同时快速有效地检测结核分枝杆菌aphC启动子、inhA、katG 3个INH耐药基因的突变 ,提高检验效率 ,有望成为临床指导用药的好方法。     

Survivin及其剪接变异体在脑胶质瘤中的表达

目的 探讨凋亡蛋白抑制因子Survivin及其剪接变异体Survivin-Δex3、Survivin-2B在脑胶质瘤发生发展中的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Survivin及其剪接变异体Survivin-Δex3、Survivin-2B mRNA在62例脑胶质瘤和10例正常脑组织标本中的表达水平.结果 Survivin、Survivin-Δex3及Survivin-2B mRNA在脑胶质瘤中表达阳性率分别为67.7%、30.6%和17.7%,三者在正常脑组织中均无表达;Survivin和Survivin-Δex3 mRNA表达阳性率在脑胶质瘤及正常脑组织之间分别具有极显著差异(P=0.000<0.01)和显著差异(P=0.010<0.05);Survivin mRNA表达阳性率在低恶性度和高恶性度脑胶质瘤之间以及脑胶质瘤不同病理级别间分别具有极显著差异(P=0.002<0.01,P=0.004<0.01).结论 Survivin在脑胶质瘤发生发展过程中具有重要作用,其剪接变异体Survivin-Δex3、Survivin-2B也发挥一定作用;Survivin可作为脑胶质瘤生物治疗的一个良好分子靶点.     

聚合酶链反应诊断女性淋病性尿道炎和宫颈炎

本文报告用聚合酶链反应诊断女性淋病性尿道炎和宫颈炎17例,将聚合酶链反应与淋菌分离培养比较,认为聚合酶链反应检测淋菌优于淋菌分离培养,具有快速、特异性和敏感性高的特点。     

自噬相关基因Beclin-1的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆并构建自噬相关基因Beclin-1原核表达载体.方法 根据Beclin-1编码区DNA序列设计引物,用前列腺癌细胞LNCaP作为模板进行RT-PCR,扩增Beclin-1编码区全基因片段,与pQE-80质粒连接后进行测序鉴定.结果 RT-PCR扩增出Beclin-1目的基因,限制性内切酶证实其已插入表达质粒中,DNA测序证实Beclin-1编码区全基因片段与GenBank公布的相应基因核苷酸序列的同源性为完全一致.结论 成功克隆并构建了自噬相关基因Beclin-1原核表达载体,为研究Beclin-1蛋白的细胞自噬作用奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表达及其促生长作用的研究

目的 构建结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rvl884c和Rv0867c基因的表达蛋白,并初步研究其促生长作用.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR技术扩增目的 基因片段;将2个片段分别克隆入克隆载体pGEx-4T-1和pUC19,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,经序列测定证实正确后,再经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST标记的Rv1884c融合蛋白和His标记的Rv0867c融合蛋白;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c和pPRO-EXHT-Rv0867c,转化人大肠杆菌DH5α中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在相对分子质量为45 000和80 000处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量分别约占菌体蛋白的18.3%和23.7%.用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱进行蛋白纯化,并研究这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv1884c和Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及研究结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础.     

CD64在临床特殊病例感染诊断中的应用分析

临床一些疾病(如重症胰腺炎、重度烧伤等)合并脓毒血症时具有病死率高和早期临床诊断难度大的特点,生物标记物的检测可提高其早期诊断准确性,降低死亡率。中性粒细胞CD64对于感染的诊断已经被广泛认可,并被认为在早期诊断中优于其他生物学标记物,且有助于感染严重程度及预后评估,但其在其他疾病或其他疾病合并感染的早期诊断中鲜有研究。本文就CD64在其他疾病及其他疾病合并感染的研究现状等进行综述,明确CD64的临床诊断意义。     

不同血清学标志物与HBV-DNA含量及Pre-S1在诊断乙肝病毒复制中的价值

目的了解乙型肝炎血清学不同标志物模式(HBV-M)与乙肝病毒DNA含量及乙肝病毒前S1蛋白的关系,为预测乙型肝炎病毒的传染程度与乙肝的预防、诊断及治疗提供实验室依据。方法采用美国ABBOTT公司生产的AXSYM全自动免疫分析仪和微粒子酶免检测试剂盒对530例携带不同血清学标志物的乙肝患者进行乙肝五项指标检测,并用聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA含量,同时,用ELS IA法检测乙肝病毒前S1抗原。结果五种HBV免疫模式中HB sA g,HB eA g和HB cA b同时阳性,其HBV-DNA定量阳性和HBV-P reS1的检出率分别为94.1%和92.8%;HB sA g,HB eA b和HB cA b阳性组的检出率分别为53.5%和40.1%;其它不同血清学模式组也有不同的阳性率。结论P re-S1可敏感反映乙型肝炎病毒的复制情况,尤其可反映HB eA g阴性的乙肝患者仍存在病毒复制。HBV-DNA含量与P re-S1呈正相关,HBV-DNA、乙肝病毒五项标志和前S1蛋白联合检测,对更好地早期诊断HBV感染,了解病毒的复制情况,疗效观察和预后判断均具有重要意义。