临床检验标本中病原微生物的DNA／RNA快速提取方法

聚合酶键反应（PCR）以其特异、敏感、快速、简便的特点，在病原微生物的检测鉴定中得到广泛应用。目前PCR技术应用于临床标本检测方面的报道越来越多［1］，但是真正应用到临床标本的直接检测时仍存在许多问题，关键问题是怎样从临床标本中直接快速地提取DNA／RNA，其提取方法的选择尤其重要，而PCR扩增关键的第一步就在于临床标本中DNA／RNA的有效提取，传统的酝一氧仿抽提法可达到较满意的纯度，但此方法操诈过程较复杂、费时；操作中要接触一些有害的化学物质；此外，残留的SDS、酚等物质对TaqDNA聚合酶具有抑制作用，可导…     

结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表达及其促生长作用的研究

目的 构建结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rvl884c和Rv0867c基因的表达蛋白,并初步研究其促生长作用.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR技术扩增目的 基因片段;将2个片段分别克隆入克隆载体pGEx-4T-1和pUC19,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,经序列测定证实正确后,再经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST标记的Rv1884c融合蛋白和His标记的Rv0867c融合蛋白;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c和pPRO-EXHT-Rv0867c,转化人大肠杆菌DH5α中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在相对分子质量为45 000和80 000处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量分别约占菌体蛋白的18.3%和23.7%.用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱进行蛋白纯化,并研究这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv1884c和Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及研究结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础.     

藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定

目的:克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法,从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化.结果:获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白,可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在,最后在变性条件下,用Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的融合蛋白纯度大于90%,Western-Blot证实获得的蛋白为所需要的目的蛋白.结论:构建了藤黄微球菌Rpf基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

CYP1A1基因多态性在子宫内膜异位症中的表达

目的　探讨CYP1A1基因多态性在子宫内膜异位症中的表达 ,了解其与子宫内膜异位症之间的关系。方法　采用PCR方法对子宫内膜异位症患者基因组DNA进行CYP1A1基因分型。结果　在 17例子宫内膜异位症标本中 ,CYP1A1I/I型频率为 0 .1176 ,CYP1A1V/V型频率为 0 .176 5 ,CYP1A1I/V型频率为 0 .70 5 9,含至少一个Val等位基因 (I/V +V/V )的频率为 0 .882 4 ,是I/I基因频率 (0 .1176 )的 7.5倍。结论　CYP1A1基因多态性中Val基因突变在子宫内膜异位症中占有很高的比例 ,提示该基因突变也许与子宫内膜异位症的发生之间有着密切联系。     

裸磁粒子对常见食源菌吸附效果的实验研究

目的 探讨裸磁粒子在不同实验条件下对常见食源菌的吸附效果,为进一步提高食(乳)品,以及水质中病原体污染的检出提供必要的前提条件. 方法采用化学反应沉淀法制备裸磁粒子,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为实验条件选择用菌株;分别对常见食源菌进行吸附效果观察;采用裸磁粒子吸附后琼脂稀释法计数残留菌数,计算其吸附率. 结果裸磁粒子用量在0.5 ml和1 ml时吸附率效果最好,平均吸附率分别为:99.17%、99.2%,说明随着用量的增加其吸附率也随之提高;作用时间结果在30～60 min之间吸附率差异无统计学意义,对3种实验菌株的吸附率均可达97%以上;作用温度结果在室温(25℃)和37℃时对3种细菌的吸附率均可达到97%以上;对10种常见病原体的吸附效果显示均具有较高吸附率. 结论裸磁粒子作为提高食源性污染菌检测的一种吸附载体,实验证实裸磁粒子对常见食源性细菌均具有较高的吸附率,为提高食(乳)品中污染菌的检出提供条件.     

靶向survivin的microRNA和siRNA抑制前列腺癌细胞survivin基因表达和凋亡作用的比较

目的：构建靶向survivin的microRNA表达载体,观察其与siRNA表达载体对survivin基因表达的抑制作用。方法：以survivin为靶基因,根据pPRIME设计针对survivin的microRNA序列,获得目的片段克隆到相应载体中,序列正确的载体脂质体转染前列腺癌PC-3细胞,RT-PCR和Western Blot检测其对survivin基因表达的抑制作用,流式细胞术和电镜观察其对细胞凋亡的影响。结果：双酶切鉴定、DNA测序证实构建的microRNA表达载体序列正确,序列正确的microR-NA和siRNA表达载体在mRNA和蛋白水平上均能明显抑制PC-3细胞中survivin的表达,流式细胞术和电镜结果显示其可促进PC-3细胞的凋亡,且microRNA表达载体的作用效果较siRNA表达载体强。结论：Survivin靶向microRNA和siRNA均能抑制靶基因的表达,诱导前列腺癌细胞凋亡,与siRNA相比,microRNA作用效果更强。     

羧肽酶A1全酶及其肽段的分泌表达及活性测定

抗体导向酶一前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy,ADEPT)自1987年由Bagshawe等提出以来,其研究受到广泛关注[1-2].     

噬菌体抗体库筛选方法的研究进展

建立高效的筛选方法是噬菌体抗体库技术实际应用的主要瓶颈.人们对传统抗体库筛选方法(固相和液相淘筛法)所涉及的抗原表位构象及筛选通量问题做了相应改进,并针对一些天然抗原难以体外制备、或为降低筛选的非特异性、或为达到规模化筛选目的而发展了一些新型的筛选方法(细胞淘筛法、组织或体内淘筛法、选择感染法和自动化淘筛法),同时对影响筛选效率的主要条件参数(封闭与洗脱条件,筛选轮数与严紧度)进行了优化研究.这些研究必将加速抗体库技术快速规模化制备抗体的普及实现.     

肿瘤的酶-前药疗法

药物在肿瘤部位的低浓度及系统毒性仍是干扰肿瘤治疗的因素之一。酶-前药疗法将酶的高效性与前药的低毒性相结合，开辟了肿瘤治疗的新领域。现综述酶-前药疗法的分类、原理、应用现状及前景。     

侵袭性曲霉病发病情况及诊治现状

侵袭性曲霉病是免疫抑制患者感染条件致病真菌引起的深部真菌感染。病情凶险，病死率很高。随着免疫抑制患者的增加，侵袭性曲霉病发病率也逐年增加，由于患者初期症状不明显，所以早期诊断比较困难，且现有的抗真菌药抗菌谱窄、毒性大，患者病死率居高不下，急需高效低毒的抗真菌药物来改善这一现状。