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61.
临床检验标本中病原微生物的DNA/RNA快速提取方法 总被引:2,自引:0,他引:2
聚合酶键反应(PCR)以其特异、敏感、快速、简便的特点,在病原微生物的检测鉴定中得到广泛应用。目前PCR技术应用于临床标本检测方面的报道越来越多[1],但是真正应用到临床标本的直接检测时仍存在许多问题,关键问题是怎样从临床标本中直接快速地提取DNA/RNA,其提取方法的选择尤其重要,而PCR扩增关键的第一步就在于临床标本中DNA/RNA的有效提取,传统的酝一氧仿抽提法可达到较满意的纯度,但此方法操诈过程较复杂、费时;操作中要接触一些有害的化学物质;此外,残留的SDS、酚等物质对TaqDNA聚合酶具有抑制作用,可导… 相似文献
62.
目的 构建结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rvl884c和Rv0867c基因的表达蛋白,并初步研究其促生长作用.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR技术扩增目的 基因片段;将2个片段分别克隆入克隆载体pGEx-4T-1和pUC19,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,经序列测定证实正确后,再经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST标记的Rv1884c融合蛋白和His标记的Rv0867c融合蛋白;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c和pPRO-EXHT-Rv0867c,转化人大肠杆菌DH5α中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在相对分子质量为45 000和80 000处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量分别约占菌体蛋白的18.3%和23.7%.用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱进行蛋白纯化,并研究这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv1884c和Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及研究结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础. 相似文献
63.
藤黄微球菌Rpf基因的克隆表达及纯化鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:克隆藤黄微球菌Rpf基因,序列测定正确后进行融合表达纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法,从藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化.结果:获得藤黄微球菌Rpf基因,得到融合6个组氨酸残基的藤黄微球菌Rpf蛋白,可溶性分析发现融合蛋白主要在包涵体中存在,最后在变性条件下,用Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的融合蛋白纯度大于90%,Western-Blot证实获得的蛋白为所需要的目的蛋白.结论:构建了藤黄微球菌Rpf基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础. 相似文献
64.
目的 探讨CYP1A1基因多态性在子宫内膜异位症中的表达 ,了解其与子宫内膜异位症之间的关系。方法 采用PCR方法对子宫内膜异位症患者基因组DNA进行CYP1A1基因分型。结果 在 17例子宫内膜异位症标本中 ,CYP1A1I/I型频率为 0 .1176 ,CYP1A1V/V型频率为 0 .176 5 ,CYP1A1I/V型频率为 0 .70 5 9,含至少一个Val等位基因 (I/V +V/V )的频率为 0 .882 4 ,是I/I基因频率 (0 .1176 )的 7.5倍。结论 CYP1A1基因多态性中Val基因突变在子宫内膜异位症中占有很高的比例 ,提示该基因突变也许与子宫内膜异位症的发生之间有着密切联系。 相似文献
65.
裸磁粒子对常见食源菌吸附效果的实验研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨裸磁粒子在不同实验条件下对常见食源菌的吸附效果,为进一步提高食(乳)品,以及水质中病原体污染的检出提供必要的前提条件. 方法采用化学反应沉淀法制备裸磁粒子,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为实验条件选择用菌株;分别对常见食源菌进行吸附效果观察;采用裸磁粒子吸附后琼脂稀释法计数残留菌数,计算其吸附率. 结果裸磁粒子用量在0.5 ml和1 ml时吸附率效果最好,平均吸附率分别为:99.17%、99.2%,说明随着用量的增加其吸附率也随之提高;作用时间结果在30~60 min之间吸附率差异无统计学意义,对3种实验菌株的吸附率均可达97%以上;作用温度结果在室温(25℃)和37℃时对3种细菌的吸附率均可达到97%以上;对10种常见病原体的吸附效果显示均具有较高吸附率. 结论裸磁粒子作为提高食源性污染菌检测的一种吸附载体,实验证实裸磁粒子对常见食源性细菌均具有较高的吸附率,为提高食(乳)品中污染菌的检出提供条件. 相似文献
66.
靶向survivin的microRNA和siRNA抑制前列腺癌细胞survivin基因表达和凋亡作用的比较 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建靶向survivin的microRNA表达载体,观察其与siRNA表达载体对survivin基因表达的抑制作用。方法:以survivin为靶基因,根据pPRIME设计针对survivin的microRNA序列,获得目的片段克隆到相应载体中,序列正确的载体脂质体转染前列腺癌PC-3细胞,RT-PCR和Western Blot检测其对survivin基因表达的抑制作用,流式细胞术和电镜观察其对细胞凋亡的影响。结果:双酶切鉴定、DNA测序证实构建的microRNA表达载体序列正确,序列正确的microR-NA和siRNA表达载体在mRNA和蛋白水平上均能明显抑制PC-3细胞中survivin的表达,流式细胞术和电镜结果显示其可促进PC-3细胞的凋亡,且microRNA表达载体的作用效果较siRNA表达载体强。结论:Survivin靶向microRNA和siRNA均能抑制靶基因的表达,诱导前列腺癌细胞凋亡,与siRNA相比,microRNA作用效果更强。 相似文献
67.
抗体导向酶一前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy,ADEPT)自1987年由Bagshawe等提出以来,其研究受到广泛关注[1-2]. 相似文献
68.
建立高效的筛选方法是噬菌体抗体库技术实际应用的主要瓶颈.人们对传统抗体库筛选方法(固相和液相淘筛法)所涉及的抗原表位构象及筛选通量问题做了相应改进,并针对一些天然抗原难以体外制备、或为降低筛选的非特异性、或为达到规模化筛选目的而发展了一些新型的筛选方法(细胞淘筛法、组织或体内淘筛法、选择感染法和自动化淘筛法),同时对影响筛选效率的主要条件参数(封闭与洗脱条件,筛选轮数与严紧度)进行了优化研究.这些研究必将加速抗体库技术快速规模化制备抗体的普及实现. 相似文献
69.
药物在肿瘤部位的低浓度及系统毒性仍是干扰肿瘤治疗的因素之一。酶-前药疗法将酶的高效性与前药的低毒性相结合,开辟了肿瘤治疗的新领域。现综述酶-前药疗法的分类、原理、应用现状及前景。 相似文献
70.