IgG Fab—BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建抗抗LPS Fab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法 通过RT－PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A3（IgG)的Fd和完整轻链（LC）cDNA片段。在分别构建了pcDCNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPI N端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白（FB）真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGH polyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果 序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3－FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mRNA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗k轻链和抗BPI抗体反应的慢白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论 成功地在CHO细胞中表达出了抗LPS Fab-BPI(FB)融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。     

聚合酶链反应快速检测结核杆菌的临床应用

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)又称体外 DNA 扩增技术或体外核酸克隆技术,自1985年初 Saiki 建立以来,在短短的几年内获得了很大发展。Hance 最先把 PCR 技术应用到结核杆菌的诊断后,国内外相继研究应用。参考国外文献,我们设计合成了一对引物。特异性地扩增结核菌 B 蛋白基     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

树突状细胞与超抗原联合诱导抗肿瘤免疫的研究

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法，并利用DC和超抗原高聚金葡素（HAS）诱导产生高效特异性抗肿瘤免疫。方法 用GM－CSF和IL－4联合刺激诱导外周血单个核细胞分化为树突状细胞。HAS活化的淋巴细胞称为HASL。将DC与同源淋巴细胞或HASL共培养，分别称为DC－L和DC－HASL。用FCS分析细胞表型，MTT法测定细胞杀伤活性，并观察对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。结果 在体外，DC－HASL对GLC－82细胞具有相对特异的杀伤作用，HASL和DC－L则无明显特异性。这三种效应细胞对荷瘤鼠的肿瘤生长都有不同程度的抑制，DC－HASL抗瘤活性最强。结论 将DC和HAS结合可诱导产生一种高效并具有相对特异性的抗肿瘤免疫活性细胞。     

抗前列腺癌多肽APP216的体外活性

目的：探讨抗前列腺癌多肽APP216对体外培养的前列腺癌细胞的杀伤作用，为抗前列腺癌新药的研究奠定基础。方法：利用MTT实验、细胞凋亡染色及流式细胞仪，检测包含有BH3、K237、DG2结构域和能被PSA特异性水解的短肽序列的多肽药物APP216对分泌PSA的前列腺癌细胞系LNCaP、22RV1及不分泌PSA的前列腺癌细胞系PC3m、DU145的杀伤作用。结果：APP216（270 μg／mL）处理48h后，前列腺癌细胞系LNCaP、22RV。的细胞生存率分别为22％和34％，72h后为10％和8％；前列腺癌细胞系PC3m、DU145的细胞生存率分别为90％和95％，72h后为87％和92％。APP216作用后，分泌PSA的前列腺癌细胞胞核呈致密浓染，或呈碎块状，有凋亡小体出现；不分泌PSA的PC3m细胞则未发现改变。APP216（270 μg／ml）处理48h后，分泌PSA的LNCaP细胞凋亡率为36．26％，不分泌PSA的PC3m细胞凋亡率仅为1．63％。结论：APP216多肽对分泌PSA的前列腺癌细胞有杀伤作用，可诱导肿瘤细胞发生凋亡；而对于不分泌PSA的前列腺癌细胞则效果不佳。证实了该多肽可被PSA特异性酶切；同时，BH3结构域可通过HIV-TAT的转导作用转入细胞内诱导凋亡。     

特异性抗前列腺癌多肽抑制前列腺癌细胞生长的作用研究

背景与目的：本实验组根据PSA具有的肿瘤定位及丝氨酸蛋白酶活性，设计并已获得了包含促细胞凋亡的BH3结构域、抗肿瘤血管形成的VEGF拮抗肽K237和bFGF拮抗肽DG2结构域以及可被PSA特异性水解短肽的复合型多肽APP216的纯化蛋白，并运用细胞培养初步验证了其在体外对前列腺癌细胞的杀伤作用，本文进一步探讨该多肽对人前列腺癌肿瘤异种移植物的杀伤作用，为抗前列腺癌新药的研究奠定基础。方法：利用检测荷瘤裸鼠血清PSA浓度、各组荷瘤裸鼠肿瘤体积、重量变化、各组荷瘤裸鼠治疗前后体重的变化以及病理组织学观察来评估包含有BH3、K237、DG2结构域和能被PSA特异性水解的短肽序列的多肽药物APP216对分泌PSA的前列腺癌细胞系22RV，荷瘤裸鼠及不分泌PSA的前列腺癌细胞系PC3荷瘤裸鼠的肿瘤细胞杀伤作用。结果：前列腺癌细胞22RV，的荷瘤裸鼠治疗后比治疗前血清PSA浓度下降了71．1％、肿瘤体积下降51％，治疗组肿瘤重量比对照组低52％，组织病理学观察镜下可见坏死瘤组织。而前列腺癌细胞PC3的荷瘤裸鼠治疗组肿瘤重量与对照组无明显差别；治疗前后肿瘤体积变化无统计学意义，组织病理学观察癌细胞生长活跃。所有裸鼠重要脏器均未见病理损伤。结论：APP216多肽对分泌PSA的前列腺癌细胞荷瘤裸鼠具有良好的抑制瘤细胞增殖的作用。而对于不分泌PSA的前列腺癌细胞荷瘤裸鼠抑瘤效果不佳。并且该蛋白对其他重要脏器无毒性。     

前列腺癌自杀基因治疗中组织特异性启动子的研究进展

随着自杀基因治疗成为治疗恶性肿瘤的重要方法,其中组织特异性启动子是目前研究的热门之一.前列腺癌自杀基因治疗常用的组织特异性启动子有PSA及Probasin等,其中PSA,Probasin为雄激素依赖性,对于未经雄激素去势治疗的前列腺癌治疗效果较好;而PSMA为雄激素非依赖性,对于是否经过雄激素去势治疗的前列腺癌均有良好疗效,适用范围广.     

前列腺癌特异DD3基因实时荧光定量PCR检测方法建立及初步应用

目的：建立实时荧光定量PCR检测特异DD3基因方法,探讨其在前列腺癌早期诊断中的应用价值．方法：根据Genebank中的DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,构建用于制备DD3基因检测的定量标准品的克隆载体;建立DD3基因的实时荧光定量方法,分别用于前列腺癌患者全血、尿液、前列腺液标本的检测．结果：经稳定性、特异性、重复性和敏感性实验评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1．64×10^3拷贝／L,线性范围为1．64×10^3～1．64×10^15拷贝／L．对临床收集的19份前列腺癌患者,20份非前列腺癌患者、30份健康者的全血、尿液及前列腺液标本进行检测．19份前列腺癌患者标本中阳性率分别为100％（全血）、80％（尿液）、100％（前列腺液）;20份非前列腺癌患者标本中只有1份前列腺液出现低拷贝值（1×10^5拷贝／L）;30份健康者标本均为阴性．在全血、尿液、前列腺液标本中,前列腺癌患者DD3 mRNA含量明显高于非前列腺癌患者和健康者（P〈0．05）．结论：DD3基因是一种用于前列腺癌早期诊断的特异性指标,可用于生物体液中少量癌细胞的检测,在前列腺癌早期诊断、微转移诊断、预后判断、指导治疗等方面均具有潜在的应用价值．     

吖啶橙荧光法检测泌尿生殖道分泌道中的沙眼衣原体

AIM:To explore the value and significance of detecting the chlamydia trachomatis(CT)from urogenital tract samples by the acridine orange fluorescence(AOF).METHODS:110 samples from urogenital tract were detected by AOF.RESULTS:The total positive rate is 49.0%,in which the male are 53.0%(16/30) the female are 45.0%(38/40).CONCLUSION:AOF is combination of fluorescence method and morphologic.It showes the characteristics of easiness and fastness,and can be used in screening the infection of the Chlamydia trachomatis.