聚合酶链反应检测肺炎衣原体方法的建立与初步应用

目的 探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在肺炎衣原体检测中的应用。方法 参照Ｃａｍｐｂｅｌｌ报道的肺炎衣原体全基因序列、Ｇ＋Ｃ比例和次级结构设计一对引物，采用ＰＣＲ法检测肺炎衣原体ＤＮＡ有临床标本中的肺炎衣原体感染。结果 经对肺炎衣原体、沙眼衣原体、大肠埃希菌、溶血性链球菌、白色念珠菌和结核分枝杆菌培养物进行ＰＣＲ扩增，结果只有肺炎衣原体出现单一４３７ｂｐ的扩增区带；敏感性试验可检测出１０ｆｇ的肺炎衣     

免疫抑制宿主巨噬细胞Toll样受体的表达变化

目的:检测小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达情况及糖皮质激素甲基强的松龙对TLRs mRNA表达的影响.方法:应用RT-PCR检测正常小鼠腹腔巨噬细胞TLR1-13的表达;并以甲基强地松龙为免疫抑制剂,诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA表达变化.结果:已发现的TLR1-13在正常小鼠腹腔巨噬细胞均有表达;小鼠腹腔巨噬细胞经糖皮质激素处理后,部分TLRs在mRNA水平上可被上调.结论:Toll样受体是抗真菌先天免疫的重要组成部分.甲基强的松龙对巨噬细胞有毒性作用,甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少.     

survivin启动子与PSMA启动子/增强子在前列腺癌细胞系中的转录活性比较

目的:通过研究并比较前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因启动子、增强子和survivin基因启动子在不同前列腺癌细胞系(LNCaP和PC-3细胞)中的转录活性,为前列腺癌的靶向性基因治疗提供依据。方法:采用PCR扩增PSMA基因的启动子、增强子和survivin基因启动子,分别克隆入pGL3-Basic,脂质体转染前列腺癌细胞和张氏肝细胞,检测各启动子在细胞中的转录活性。结果:survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,均明显高于PSMA启动子/增强子,其中S2pro启动活性最强,达到CMV启动子活性的1/3,然而,survivin启动子及PSMA启动子/增强子在肝细胞系中几乎不表达。结论:survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,可望成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

特异性抗前列腺癌多肽抑制前列腺癌细胞生长的作用研究

背景与目的：本实验组根据PSA具有的肿瘤定位及丝氨酸蛋白酶活性，设计并已获得了包含促细胞凋亡的BH3结构域、抗肿瘤血管形成的VEGF拮抗肽K237和bFGF拮抗肽DG2结构域以及可被PSA特异性水解短肽的复合型多肽APP216的纯化蛋白，并运用细胞培养初步验证了其在体外对前列腺癌细胞的杀伤作用，本文进一步探讨该多肽对人前列腺癌肿瘤异种移植物的杀伤作用，为抗前列腺癌新药的研究奠定基础。方法：利用检测荷瘤裸鼠血清PSA浓度、各组荷瘤裸鼠肿瘤体积、重量变化、各组荷瘤裸鼠治疗前后体重的变化以及病理组织学观察来评估包含有BH3、K237、DG2结构域和能被PSA特异性水解的短肽序列的多肽药物APP216对分泌PSA的前列腺癌细胞系22RV，荷瘤裸鼠及不分泌PSA的前列腺癌细胞系PC3荷瘤裸鼠的肿瘤细胞杀伤作用。结果：前列腺癌细胞22RV，的荷瘤裸鼠治疗后比治疗前血清PSA浓度下降了71．1％、肿瘤体积下降51％，治疗组肿瘤重量比对照组低52％，组织病理学观察镜下可见坏死瘤组织。而前列腺癌细胞PC3的荷瘤裸鼠治疗组肿瘤重量与对照组无明显差别；治疗前后肿瘤体积变化无统计学意义，组织病理学观察癌细胞生长活跃。所有裸鼠重要脏器均未见病理损伤。结论：APP216多肽对分泌PSA的前列腺癌细胞荷瘤裸鼠具有良好的抑制瘤细胞增殖的作用。而对于不分泌PSA的前列腺癌细胞荷瘤裸鼠抑瘤效果不佳。并且该蛋白对其他重要脏器无毒性。     

多肽K237与前列腺癌细胞系LNcap的亲和性

目的:研究多肽K237与前列腺癌细胞系LNcap的亲和性。方法:采用免疫组化染色和RT-PCR,检测与K237结合的VEGF受体KDR的表达;用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察多肽K237与前列腺癌细胞系LNcap的结合能力。结果:前列腺癌细胞系LNcap中有KDR的表达;流式结果显示:多肽K237以浓度依赖性与LNcap细胞结合。激光共聚焦显微镜可观察到,多肽K237结合在LNcap细胞的胞浆和胞膜中。结论:多肽K237对前列腺癌细胞系LNcap具有较高的亲和性,为利用多肽K237通过抑制自分泌途径从而抑制前列腺癌细胞的增殖提供了基础,为肿瘤的治疗提供了新的方法。     

一株宽宿主谱大肠埃希菌噬菌体的RNA比较分析及其环境微生物杀灭效应观察

目的通过比较研究一株分离自医院污水的宽宿主范围大肠埃希菌(E．coli)噬菌体与野生型单一宿主谱E．coli噬菌体的核酸序列和微生物杀灭效应等生物学特性的改变探讨噬菌体识别特异性机制和将噬菌体作为生物消毒剂应用于环境污水净化的可行性。方法采用抗体沉淀-盐酸胍一步法分别提取单一宿主谱E．coli噬菌体f2株及宽宿主谱E、coli噬菌体株的RNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度；采用简并引物逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及随机引物随机扩增多态性DNA(RAPD)-PCR比较分析噬菌体宿主谱改变时核酸序列组成的变化；通过以上两噬菌体对环境样本中活菌和E．coil的杀灭效果的观察，比较分析宿主谱改变对噬菌体的微生物杀灭效应这一生物学特性的影响。结果噬菌体核酸分析试验证实，f2噬菌体及宽噬噬菌体均为6000bp左右的单链RNA噬菌体。RAPD—PCR结果显示，两噬菌体基因eDNA扩增出的RAPD—DNA片段有明显的差异，其中26条为可区分的DNA带型。利用简并引物进行的RT—PCR反应显示，噬菌体f2cDNA在450bp附近出现重复性较好的扩增片段，而宽噬噬菌体cDNA在相同条件下未出现扩增产物。环境水样本微生物杀灭试验结果显示，宽宿主谱株噬菌体对环境水样本中的E．coli杀灭率为36．75％～56．28％，对水样本中活菌杀灭率为30.84％～47．96％；而噬菌体f2对环境水样本中的E．coli杀灭率则为19．19％～35．06％，对水样本中活菌杀灭率为13．05％～27.85％。结论宽宿主谱噬菌体微生物杀灭率明显高于野生型单一宿主谱噬菌体f2(P=0．000)；核酸分析证实两噬菌体宿主特异性裂解效应已从基因水平发牛了变化。     

抗前列腺癌多肽APP216的体外活性

目的：探讨抗前列腺癌多肽APP216对体外培养的前列腺癌细胞的杀伤作用，为抗前列腺癌新药的研究奠定基础。方法：利用MTT实验、细胞凋亡染色及流式细胞仪，检测包含有BH3、K237、DG2结构域和能被PSA特异性水解的短肽序列的多肽药物APP216对分泌PSA的前列腺癌细胞系LNCaP、22RV1及不分泌PSA的前列腺癌细胞系PC3m、DU145的杀伤作用。结果：APP216（270 μg／mL）处理48h后，前列腺癌细胞系LNCaP、22RV。的细胞生存率分别为22％和34％，72h后为10％和8％；前列腺癌细胞系PC3m、DU145的细胞生存率分别为90％和95％，72h后为87％和92％。APP216作用后，分泌PSA的前列腺癌细胞胞核呈致密浓染，或呈碎块状，有凋亡小体出现；不分泌PSA的PC3m细胞则未发现改变。APP216（270 μg／ml）处理48h后，分泌PSA的LNCaP细胞凋亡率为36．26％，不分泌PSA的PC3m细胞凋亡率仅为1．63％。结论：APP216多肽对分泌PSA的前列腺癌细胞有杀伤作用，可诱导肿瘤细胞发生凋亡；而对于不分泌PSA的前列腺癌细胞则效果不佳。证实了该多肽可被PSA特异性酶切；同时，BH3结构域可通过HIV-TAT的转导作用转入细胞内诱导凋亡。     

树突状细胞与超抗原联合诱导抗肿瘤免疫的研究

目的 建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法，并利用DC和超抗原高聚金葡素（HAS）诱导产生高效特异性抗肿瘤免疫。方法 用GM－CSF和IL－4联合刺激诱导外周血单个核细胞分化为树突状细胞。HAS活化的淋巴细胞称为HASL。将DC与同源淋巴细胞或HASL共培养，分别称为DC－L和DC－HASL。用FCS分析细胞表型，MTT法测定细胞杀伤活性，并观察对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。结果 在体外，DC－HASL对GLC－82细胞具有相对特异的杀伤作用，HASL和DC－L则无明显特异性。这三种效应细胞对荷瘤鼠的肿瘤生长都有不同程度的抑制，DC－HASL抗瘤活性最强。结论 将DC和HAS结合可诱导产生一种高效并具有相对特异性的抗肿瘤免疫活性细胞。