双向凝胶电泳和质谱技术在视网膜蛋白质表达研究中的应用

目前对视网膜功能的研究大多停留在形态学和基因组水平，这些研究并不能反映基因转录后的调控、蛋白质表达水平的变化以及蛋白质的翻译后修饰等信息，且细胞内mRNA水平和蛋白质的丰度并不完全一致，所以从蛋白质水平上研究视网膜的功能显得尤为重要。与DNA的提取和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）不同，组织或器官蛋白质用于蛋白质组学研究时，其蛋白质的抽提方法、双向电泳和质谱鉴定的条件都不完全相同。[第一段]     

医学形态学实验课程体系的构建

实验教学作为理论联系实际的重要环节对学生实践能力和创新思维的培养具有重要作用。本文针对目前国内医学院校形态学实验教学的现状,提出了将病理学和组织胚胎学整合为医学形态学和形态实验学,并建立独立的形态学实验教学体系的改革思路和具体措施。     

CD34、CD14、CD10、CD31和因子Ⅷ在人胚胎卵黄囊血岛、AGM区和肝造血细胞中的表达

目的研究CD34、CD31、CD14、CD10和凝血因子Ⅷ(FⅧ)在人胚胎发育第3～12周卵黄囊血岛、PAS／主动脉-生殖腺-中肾(AGM)区和肝造血细胞的表达。方法药物流产受精龄3～12周人胚胎共32例，石蜡包埋切片，苏木精一伊红和免疫组化染色，光镜观察。结果第3～4周人胚卵黄囊血岛由外周的血管内皮细胞和中心的造血细胞组成。血岛的血管内皮细胞和造血细胞均为CD10、CD14、CD31和FⅧ表达阳性。此外，血管内皮细胞还表达CD34，而造血细胞为CD34阴性。第32天，卵黄囊血岛的造血细胞已经迁移。在第4周，主动脉、中肾和肝造血灶内开始出现CD34、CD10、CD14、CD31和FⅧ阳性的造血细胞。到第7周，CD10、CD14阳性细胞数量达到最高。到第11～12周，上述各区域中多为无核的红细胞，CD34、CD10、CD14、CD31和FⅧ表达为阴性。第4～12周，胚体内所有血管内皮细胞均为CD34阳性。结论卵黄囊血岛造血细胞和内皮细胞共表达CD10、CD14、CD31和FⅧ，卵黄囊血管内皮细胞表达CD34，而造血细胞不表达CD34。背主动脉、中肾和肝的造血细胞主要在第4～7周表达CD34、CD10、CD14、CD31和FⅧ。抗CD34抗体可标记人胚胎3-12周各种血管的内皮细胞。     

大鼠脑缺血再灌注时小胶质细胞活化与外源性巨噬细胞补充

目的：观察脑缺血再灌注时小胶质细胞的活化和外源性巨噬细胞来源。方法：阻塞大鼠大脑中动脉2h再灌注0．5～48h制成脑缺血模型，凝集素GSI-B4组化法观察小胶质细胞／巨噬细胞在脑组织的分布、免疫组化观察室管膜细胞增殖及分化。结果：再灌注0．5h，可见大量形态各异的GSI—B4阳性的小胶质细胞与巨噬细胞，随后下降，12～48h数量持续增高，并呈不同的形态。各实验组，室管膜及室管膜下层有细胞增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)强阳性细胞。杏仁核、杏仁皮质核、视前区及其软脑膜有PCNA强阳性细胞和GSI-B4强阳性阿米巴样巨噬细胞。再灌注24h组，有PCNA与白细胞共同抗原45RB(leukocyte common antigen,CD45RB)双标阳性的细胞。结论：缺血再灌注时，不同损伤区域小胶质细胞形态呈明显的异形性，外源性巨噬细胞可能来自脑膜巨噬细胞和室管膜及室管膜下层的增生、浸润和迁移。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞定向分化的能力

目的：研究绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchvmal stem celis，MSCs)体外扩增及其向内皮细胞定向分化能力，为血管组织工程在体研究提供实验依据。方法：实验于2003—10／2004—10在第三军医大学基础部解剖学教研室完成。无菌条件下采集绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓，用直接贴壁法获得小鼠MSCs，然后以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth faclor，vEGF)进行诱导分化，最后对扩增的细胞特征进行八因子(Willbrand factor，vWF)免疫荧光鉴定观察。结果：MSCs每扩增一代，细胞数量增加4～8倍，7．0&;#215;10^3个原代MSCs体外扩增3代即获得1．4&;#215;10^8个细胞。在70％～80％融合时呈现“铺路石”样形态，说明绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增条件与一般小鼠相同。添加VEGF诱导2周后，以免疫荧光法检测细胞的vWF的表达发现，诱导组的vWF呈阳性表达，对照组vWF表达呈阴性。结论：绿色荧光蛋白转基因小鼠MSCs在体外的培养扩增能力强，在vEGF作用下可以向内皮细胞转化。     

差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠骨髓问充质干细胞（BMSCs）。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、9．4h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、9．4h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。     

肝型脂肪酸结合蛋白及血管内皮生长因子在原发性肝癌中的表达以及相互关系

目的 研究肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)与血管内皮生长因子(VEGF)在原发性肝癌中的表达变化,探讨二者在原发性肝癌发生、发展中的作用及相互关系.方法 采用RT-PCR及免疫组织化学技术,检测61例手术切除的病人肝癌组织及癌旁组织中L-FABP、VEGF的mRNA及蛋白质的表达水平,并做统计学处理.结果 RT-PCR结果显示,肝癌L-FABP以及VEGF在mRNA表达水平明显高于癌旁组织(L-FABP:0.97±0.12,0.83±0.14,t=5.21,P＜0.05;VEGF:0.92±0.11,0.59±0.15,t=11.79,P＜0.05).免疫组化染色发现,L-FABP阳性反应物主要存在于细胞浆,肝癌组阳性反应物灰度值明显高于癌旁对照组(肝癌组:92.73±7.67,癌旁对照组:82.83±6.90,t=7.44,P＜0.05),阳性细胞计数肝癌组高于癌旁对照组(肝癌组:92.18±4.44,癌旁对照组:84.52±6.43,t=5.94,P＜0.05);肝癌细胞胞浆有VEGF阳性反应物,在癌旁组织细胞则偶见VEGF阳性反应物,差异有显著性(肝癌组:88.69±5.56,癌旁对照组:77.61±5.93,t=8.72,P＜0.05).相关性分析表明L-FABP以及VEGF在肝癌组织与癌旁组织中在mRNA和蛋白质水平上均有正相关性(P＜0.05).结论 L-FABP、VEGF基因以及蛋白质在肝癌组织中表达均显著上调,并且二者具有正相关性,我们推测L-FABP在获取更多的脂肪酸的同时可以促进血管的增生,进而促进了肝癌的发展.     

家兔腓肠肌亚部神经切断对其肌内神经、运动终板和肌梭的影响

目的　切断家兔腓肠肌外侧头肌亚部神经后 ,观察肌内神经、肌梭、运动终板带、肌湿重等的形态学变化。方法　 4 0只家兔随机分成对照组和神经切断组。用Sihler s肌内神经染色法染肌内神经 ;用乙酰胆碱脂酶整肌染色法染肌运动终板 ;用HE染色法染肌梭。结果　 (1)术后 2周亚部肌湿重明显下降 (P <0 0 5 ) ,肌运动终板带模糊不清 ,肌内神经染色变浅 ,三级分支消失 ,但肌梭形态及梭内肌纤维尚无明显改变 ;(2 )术后 4周肌湿重进一步下降 (P <0 0 1) ,运动终板带完全消失 ,肌内二级分支染色无 ,肌梭形态及数量有改变 ;(3)术后 12周肌肉明显萎缩 ,发生纤维化 ,运动终板带无 ,肌内神经染色无 ,仅留有鞘管样结构 ,未见神经再生 ,肌梭形态、数量明显改变 ;(4)术后 16周各参数与 12周相比差异无显著性。邻近正常肌未见有侧支神经支配失神经的亚部。结论　 (1)家兔腓肠肌外侧头各亚部在神经切断术后 4周 ,运动终板、肌梭的数量和形态有改变 ;(2 ) 12周后肌内神经染色仅有神经外膜鞘管样结构残存 ;(3)术后 16周末见原位的神经再生和相邻亚部神经侧支的再支配。     

转化生长因子-β可以诱导骺板软骨细胞表达细胞增殖核抗原

了解转化生长因子－β诱导骺板软骨细胞增殖的作用。方法：采用鸡股股骨无血清培养、ＰＣＮＡ免疫染色方法研究对骺板软骨细胞增殖的作用。结果：ＰＣＮＡ阳性软件骨细胞数目与分布部位与ＴＧＦ－β作用剂量、时间密切相关,ＰＣＮＡ阳性细胞分布区域和数目远多于对照组,根据染色情况可以将ＰＣＮＡ阳性细胞分为Ｓ期和非Ｓ期细胞二种。结论：ＴＧＦ－β能诱导非增殖软骨细胞表达ＰＣＮＡ,用ＰＣＮＡ作为细胞增殖的指标是不适宜的。