重组毕赤酵母菌高密度表达人源抗-HBs Fab抗体的研究

目的探讨抗-HBsFab抗体发酵工程菌GS115／Fab的高密度发酵及对发酵产物的纯化与活性鉴定方法。方法采用补料分批培养方法,在5L发酵罐中对发酵工程菌GS115／Fab进行高密度发酵,发酵温度28～30℃,pH值范围为5．0～5．5,溶氧范围20％以上;3次发酵分别于OD600值达到400～450、200～250、300～350时开始诱导,甲醇诱导浓度为0．5％～1％,经96h左右的诱导后终止发酵,对发酵上清进行亲和纯化,并通过ELISA法对纯化产物进行活性鉴定。结果在OD600为300～350时开始诱导有利于发酵过程条件的控制和目的蛋白的表达,目的蛋白表达量为245mg／L。发酵上清通过亲和层析纯化,获得纯度为98％的重组Fab抗体,该抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力及特异性。结论Fab酵母菌工程菌在5L发酵罐高密度发酵成功,为抗-HBsFab抗体的产业化生产及临床研究奠定了基础。     

重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化方法比较研究

目的研究重组人抗HBsAg Fab抗体的纯化条件。方法采用羊抗人Fab抗体亲和层析柱、14F7单克隆抗体亲和层析柱、离子交换-分子筛层析柱,分别纯化由酵母工程菌(Gs115／Fab)发酵的重组人抗HBsAg Fab抗体,并对3种纯化方法所得Fab抗体的纯度、收率、与HBsAg的结合活性进行比较。结果3种纯化方法中,14W单克隆抗体柱纯化的Fab抗体的纯度达98％左右,Fab抗体柱纯化的Fab抗体的纯度为95％,但这两种亲和柱的目的蛋白收率都不高,分别为35％、55％。而离子交换柱纯化的Fab抗体的纯度为93．8％,经分子筛柱进一步纯化后,可达98％以上,Fab抗体蛋白收率可达80％以上。经ELISA分析,3种方法纯化的Fab抗体均具有较高的HBsAg抗原结合力和特异性。结论通过对3种纯化方法的比较得出,离子交换一分子筛层析法是重组人抗HBsAg Fab抗体的最佳纯化方法,这为抗HBsAg Fab抗体的产业化生产和临床研究打下良好基础。     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。     

人源性抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中的表达及活性测定

目的 :制备有活性的人源性抗HBsAg单链抗体。方法 :应用噬菌体表面呈现技术获得人抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体的Fab片段 ,并将VH 和VL 基因以 (Gly4Ser) 3linker连接成单链 ,插入表达载体pQE40 ,筛选大肠杆菌高表达菌株。结果 :工程菌表达优化试验表明 ,在OD6 0 0 为 0 6时开始诱导 ,持续 6h ,目的蛋白表达量最高可达菌体总蛋白的 31%。包涵体变性后上样镍离子螯合层析柱一步纯化 ,收集目的峰 ,透析复性 ,得纯度为 97%的重组单链抗体 ,其亲和常数为 0 2 3× 10 8mol L。结论 :抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌内获得高效表达 ,经变性和复性 ,得到有活性的单链抗体 ,氨基酸组成正确。为进行临床前研究打下基础。     

基因工程人抗体Fab片段的纯化及鉴定

 目的通过亲和层析的方法纯化基因工程人抗体Fab(Fragment,antigen binding)片段.方法对可以表达人抗体Fab的菌种进行诱导,冻融裂菌离心收集上清,进行亲和层析并对纯化前后的样品进行电泳分析及Western blot检测.结果SDS-PAGE电泳显示纯化品在还原、非还原条件下均为单一条带.Western blot分析层析前抗体Fab片段还原的分子量在2.4×104左右,非还原的分子量约为4.8×104,而经过亲和层析后,在凝胶电泳上纯化品在还原、非还原条件下在相应位置上均显示单一蛋白带.结论我们可以经过亲和层析,纯化基因工程抗体Fab片段.     

乳猪肾提取液预防顺铂致死性的初步研究

探讨乳猪肾提取液对顺铂致死性的预防作用。方法：实验分为单独皮下注射顺铂组及肾提取液预防组,观察各组动物的死亡率及肾功能损害程度。结果：单独顺铂组小鼠死亡率为３１．３０％肾提取液预防组为０．００％,Ｐ＜０．０５：单独顺铂组大鼠血清尿素氮为３０．６５±１２．７３,肾提取液预防组为２５．７４±２．５３,Ｐ＞０．０５、但后者有下降趋势。结论;肾提取液对顺铂致死性有一定的预防作用,其机理可能是减轻了顺铂的肾毒性     

肝靶向抗病毒药NGA-ACV的制备及其趋肝性

以无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGP-R)的特异性配体——半乳糖基拟糖白蛋白(neoglycoalbumin,NGA)为载体,通过丁二酰基桥将抗病毒药无环鸟苷(acyclovir,ACV)与NGA偶联,得到肝靶向抗病毒药NGA-ACV。差热分析和高效液相色谱分析结果表明,NGA-ACV是共价键偶联物,且在血液中稳定性很好。将偶联物用¹³¹I标记后进行家兔放射性显像比较研究。结果,高、低药密度NGA-ACV的肝脏放射性分别是全身放射性的81.6%和86.6%,其趋肝性无明显差别。研究小鼠体内高药密度¹³¹I-NGA-ACV的分布,在5min时肝脏放射性达到峰值,为注入量的81.7±10.4%。受体竞争抑制实验表明NGA-ACV的肝靶向机理为受体介导的主动靶向过程。初步体外抗乙肝病毒比较研究表明,NGA-ACV较ACV的抗病毒剂量有明显降低。     

人抗-HBsAg Fab段抗体的表达

目的 观察从已构建的人抗－HBsAg噬菌抗体库中筛选出的特异笥抗体的表达情况。方法 构建溶性Fab段表达载体，进行SDS－PAGE和免疫印迹试验检测其表达的情况，并通过ELISA实验证明Fab段抗体对HBsAg具有亲和力。结果 所得到抗体在还原条件和非还原条件下的表达情况与预期相同。结论 观察到的抗体的表达情况为进行大量制备纯化奠定了基础。