hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。     

人纤溶酶原半胱氨酸卷曲区5(hPK-5)基因在4种工程菌株中表达差异性研究

目的:探索表达人纤溶酶原半胱氨酸卷曲区5(hPK-5)的最佳菌株,为研究其抑制内皮细胞增殖和迁移的活性,开发肿瘤治疗和预防肿瘤转移的新药提供前提.方法:在将人纤溶酶原半胱氨酸卷曲区5(hPK-5)基因与原核表达载体pBV220进行体外重组获得表达质粒pBV220/hPK-5,采用氯化钙转化法将重组质粒分别导入BL21(DE3)、DH5α,JM109和BL21(DE3)-pLyss 4种工程菌,在温控诱导表达条件下进行相同表达条件和优化表达条件下的hPK-5因子表达差异性研究.结果:工程微生物(本研究为工程菌株)的筛选、培养条件的建立、外源基因表达条件的建立是优化基因工程技术体系的重要技术环节.结论:本研究为hPK5因子的进一步深入研究以及产业化的发展奠定了基础.     

人肝细胞生长因子α原核表达体系的构建及表达

人肝细胞生长因子(humanhepato cytegrowthfactor,hHGF)由α和β链组成,为进一步研究hHGFα的生物学功能,我们采用转录前加工修饰方法,构建了hHGFα原核表达体系。根据人HGF全长基因序列设计引物,上游5′ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA 3′;下游5′ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTGTTTCG 3′。以含有hHGFcDNA全序列的质粒pRC/CMV hHGF为模板扩增全长1340bp的hHGFαcDNA ,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后,回收纯化目的条带,以XhoⅠ切为386和95 4bp 2个片段,再分别用EcoRⅠ和BamHⅠ消化后亚克隆入载体pBS…     

AP-2α对大肠癌SW620细胞增生的影响及其作用机制

目的研究转录因子激活蛋白-2d（AP-2α）对大肠癌细胞株SW620增生能力的影响及可能的作用机制。方法构建pcDNA3．1（＋）-AP-2α重组质粒,采用脂质体介导质粒转染人SW620细胞,利用MTT法检测其对SW620细胞增生能力的影响;荧光定量PCR方法和Western印迹法检测转染前后各组细胞中雌激素受体-β（ER-β）表达水平的变化。结果转染AP-2α后SW620细胞内AP-2α mRNA含量及蛋白表达水平显著升高。MTT结果提示,转染AP-2α基因后SW620细胞增生速度受到抑制。转染AP-2α基因后ER-β mRNA和蛋白表达增加,且在转染48h增加最为明显,ER—β mRNA和蛋白质分别增加了94．47％和54．67％,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AP-2α可抑制SW620细胞的增生,其抑制机制很可能与增强ER-β的表达有关。     

RNA干扰沉默Sp1基因抑制大肠癌SW620细胞的恶性增生

目的采用RNA干扰技术沉默大肠癌SW620细胞转录因子特化蛋白1（Sp1）的表达,观察其对细胞增生的影响。方法构建靶向人Sp1基因的干扰载体（pGenesil-1-Sp1）,脂质体介导转染SW620细胞,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用实时荧光定量PCR和Western blotting检测其对Sp1 mRNA及蛋白质水平的影响,MTT法检测SW620细胞增生活性的改变。结果成功构建针对Sp1的干扰载体,转染后能够有效抑制大肠癌SW620细胞中Sp1 mRNA和蛋白的表达,且在转染48h抑制作用最强,其对Sp1 mRNA和蛋白质抑制率分别为68．47％和73．82％,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。MTT实验显示,下调Sp1表达可显著抑制大肠癌SW620细胞的体外增生能力。结论Sp1基因沉默能够抑制人大肠癌SW620细胞的增生,为以Sp1为靶点的大肠癌基因治疗提供新的思路和手段。     

赤子爱胜蚓核酸酶样蛋白的一级结构特征

背景：前期研究从赤子爱胜蚓组织中获得一组核酸酶样蛋白,对该组核酸酶样蛋白的一级结构进行研究,有利于揭示其结构的基本性质,为进一步结构与功能的研究奠定基础。 目的：对核酸酶样蛋白EWD1和EWD2进行一级结构的测定。 方法：采用Edman降解法测定EWD1和EWD2的N末端氨基酸序列,采用酸水解法测定其氨基酸组成, LC-MS/MS测定蛋白质内部分氨基酸的序列,MALDI-TOF-MS测定蛋白的含糖量和二硫键数目。 结果与结论：核酸酶样蛋白EWD1和EWD2的氨基酸组成中,天冬氨酸和天冬酰胺之和的含量最高,都达到近10%,疏水氨基酸亮氨酸的含量也较高,半胱氨酸含量较少,氨基酸组成比较显示,该2种酶与其它核酸酶较相似。Edman降解法测定,EWD1蛋白大亚基的N末端6个氨基酸序列为：D、E、W、V、Y、P,EWD2蛋白的N末端9个氨基酸序列为：L、L、G、P、Y、K、P、K、C;串,联质谱的结果提示2种核酸酶为新蛋白;MALDI-TOF-MS法显示1号核酸酶中含有8个半胱氨酸,形成4对二硫键,2号核酸酶中有6个半胱氨酸,形成3对二硫键。EWD1,2均为糖蛋白,EWD1中的含糖量为17.3%,EWD2蛋白中的含糖量为15.6%。     

老年大鼠的慢性硒中毒

目的　探讨老年大鼠对硒的耐受剂量 ,并比较有机硒 (富硒平菇 )与亚硒酸钠的优劣。方法　在正常饲料的基础上 ,分别加亚硒酸钠、普通平菇干粉、富硒平菇干粉配成含硒量为 0 9、0 3、0 2、0 172mg/kg混合饲料 ,对 18个月龄的Wistar大鼠进行实验 ,实验期 10 2d。观察实验前后体重变化、生存时间、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH PX)活性、血红蛋白 (Hb)含量、丙氨酸转氨酶 (ALT)活性、尿素氮 (BUN)含量以及脂质过氧化物 (LPO)含量和超氧化物歧化酶 (SOD)活性。结果　①亚硒酸钠 0 9mg/kg组GSH PX活性随喂养时间延长活性降低、富硒平菇 0 9、0 3mg/kg两组均随时间延长而活性增加。②雄、雌性大鼠在实验前后体重有显著变化 ,雄性减重、雌性增重。③富硒平菇和亚硒酸钠 0 9mg/kg两组生存时间均有降低。④亚硒酸钠 0 9mg/kg组Hb含量降低、ALT活性增高。⑤普通平菇组Hb含量有所增高。⑥富硒平菇 0 3mg/kg组LPO含量降低。结论　亚硒酸钠 0 9mg/kg饲料长时间补充对老年鼠有毒害作用。而适量硒的补充 ,特别是富硒平菇适量硒剂量的补充则有益     

生物化学实验教学课程体系改革的创新实践

为进一步提高生物化学实验课教学质量,我们对实验教学进行了一次全新的改革尝试：重新确定教材大纲、系统规划课程体系、改变课堂教学模式、加强辅助教学手段、搭建多元化高新实验技术平台、制定综合性发展性考核评价标准,形成一套行之有效的实验课程教学新体系,为生化实验教学的继续深入改革奠定了基础。     

重组人肝细胞生长因子β链工程菌的高密度发酵

目的　实现重组人肝细胞生长因子 β链 (rhHGFβ)工程菌的高密度高表达发酵。 方法　首先在摇瓶中进行了培养条件的摸索 ,确定了该工程菌的培养条件、诱导起始时间和诱导时间 ,然后用 15L自控发酵罐进行分批补料培养 ,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源 ,保持溶氧在 30 %以上。结果　菌体发酵密度达到 39g/L(湿菌重 ) ,达到并超过了重组蛋白在摇瓶中的表达水平 ,重组蛋白的表达占菌体总蛋白的 30 %左右。结论　本研究为rhHGFβ进一步下游纯化及功能研究奠定了基础。     

构建靶向性载脂蛋白E修饰脂质体介导的HSVtk/丙氧鸟苷系统

背景：自杀基因系统无选择性,不仅能杀伤癌细胞,对正常细胞也有同样作用,所以构建靶向性基因治疗载体成为迫切需要解决的问题。
　　目的：评价载脂蛋白E修饰脂质体(apoE-lipoplexes)介导TK/丙氧鸟苷自杀基因质粒转染对Li-7肝癌细胞的杀伤效果。
　　方法：apoE-lipoplexes包裹pAFP-TK-IRES2-EGFP真核表达质粒转染Li-7细胞,筛选HSVtk稳定表达细胞克隆(Li-7-tk),荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白表达,Western blotting检测HSVtk基因表达,MTT法评价HSVtk/丙氧鸟苷系统对Li-7肝癌细胞的杀伤作用。
　　结果与结论：自杀基因质粒转染Li-7细胞经筛选得到稳定克隆(Li-7-tk),HSVtk/丙氧鸟苷系统作用于 Li-7细胞后,细胞凋亡明显增加(P<0.01)。在甲胎蛋白阳性的Li-7肝癌细胞中,自杀基因载体稳定表达并有效杀灭癌细胞。