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11.
目的 用腺病毒载体介导的人白血病抑制因子基因(Ad-hLIF)感染WI-38人胚肺成纤维细胞制备饲养层细胞,体外观察转基因细胞对CD34+造血干/柑细胞增殖和分化的影响,体内研究对辐射损伤SCID小鼠造血功能恢复的效果.方法 用RT-PCR和ELISA法鉴定Ad-hLIF转基因饲养层细胞目的 基因的表达后,将经免疫磁珠法分离和流式细胞术检测后的CD34+细胞在饲养层和/或细胞因子培养体系中扩增28 d,检测不同时间点的单个核细胞(MNC)数量及CD34+细胞阳性率;扩增后的MNC经CFDA SE荧光标记后移植入辐射损伤SCID小鼠体内,RT-PCR和细胞荧光标记法检测小鼠内含Alu基因人源细胞的门巢情况.结果 感染50MOI(multiplicity of infection)Ad-hLIF的饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR和ELISA法结果 显示hLIF目的 基因能在WI-38饲养层细胞中表达,免疫磁珠法分离的CD34+造血干/祖细胞经流式细胞术检测其纯度可达95.60%±2.58%,MNC在Ad-hLIF转基因饲养层培养体系持续扩增,最高可达356.95±0.87倍,其中CD34+细胞仪在0~14 d能维持较高水平,最高可扩增52.11±1.13倍,以后逐渐降低.将其移植辐射损伤SCID小鼠后,可明显提高小鼠存活率,4周内小鼠骨髓中不仅可观察到CFDA SE荧光标记的细胞,而且经RT-PCR法搭定后.还可检测到表达Alu人源基因的人脐血造血归巢细胞.结论 成功建立的Ad-hLIF转基因饲养层细胞不仅体外可以有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.扩增的CD34+细胞对辐射损伤SCID小鼠具有造血功能恢复的功能. 相似文献
12.
目的:获取rhIL-18原核表达产物并研究其活性。方法:用本室构建的含基因重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌DHSot,经42℃热诱导表达和包涵体提取纯化后获取rhIL-18蛋白;采用ELISA试剂盒检测rhIL-18刺激PBMC分泌IFN-γ的活性及MTT法检测其对NK细胞杀伤K562细胞自然杀伤活性;同时用荷瘤小鼠模型检测其体内抗瘤功能。结果:诱导含重组表达载体PBV220-IL-18的大肠杆菌D145ct后,蛋白电泳显示出一条相对分子量(Mτ)为18000的蛋白条带;10μg rhIL-18蛋白体外刺激PBMC后,其分泌IFN-γ的能力与对照组相比提高了8倍,细胞毒性提高3倍;同时rhIL-18蛋白能明显抑制肿瘤生长和延长荷瘤鼠生存期。结论:获得了有免疫调节功能和抗肿瘤活性的rhIL-18蛋白。为今后IL-18重组产物的研制和开展肿瘤的生物治疗提供了实验依据。 相似文献
13.
目的 :对比研究α1b、α2b干扰素治疗单纯疱疹病毒角膜炎的疗效。方法 :46例单纯疱疹病毒性角膜炎患者随机分为两组 ,A组 ( 2 9例 2 9眼 )滴IFNα1b眼液 (滴宁眼液 ) ,B组 ( 17例 17眼 )滴IFNα2b眼液 (安达芬 )。结果 :角膜溃疡平均愈合时间 :A组 12 87± 2 12天 ,B组 9 45± 3 0 4天 (P <0 0 1)。结论 :IFNα2b治疗单纯疱疹病毒性角膜炎与IFNα1b相比疗效略好。 相似文献
14.
目的构建人白介素24(hIL-24)的腺病毒载体,获得hIL-24重组腺病毒子,为hIL-24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3.0-hIL-24重组质料为模板,PCR扩增hIL-24,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack—CMVR质粒上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack—CMV-hIL-24,与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hIL-24,经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞。收获腺病毒重组病毒子,RT-PCR和Western—blotting鉴定。结果测序结果显示hIL-24序列正确,RT—PCR和Western-blotting检测到了hIL-24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack,CMV—hIL-24。获得了人白介素24重组病毒子Ad-hIL-24。 相似文献
15.
目的:构建重组人源化hING4基因并探究其对肺癌细胞的生长抑制效应.方法:以pcDNA3.0-mING4重组质粒为模板.通过定点突变技术构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad-hING4基因.用荧光显微镜和RT-PCR法检测hING4在肺癌细胞中的表达;Westem印迹法检测hING4对肺癌细胞中Bax、Bcl-2表达的影响;集落形成试验和FCM法检测hING4对肺癌细胞增殖和凋亡影响.结果:基因测序和PCR结果提示成功构建人源化Ad-hING4基因;并能在肺癌细胞中表达,对肺癌细胞有细胞毒作用;Westem印迹法检测结果提示基因在上调Bax表达同时下调Bel-2的表达;集落形成试验、FCM检测结果提示hING4基因可抑制肺癌细胞增殖并诱导凋亡.结论:成功构建了Ad-hING4基因,并能在体外抑制肺癌细胞生长. 相似文献
16.
目的 克隆人硫氧还蛋白(hTRX)基因,并构建含有该目的 基因的重组逆转录病毒载体。方法 利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞总RNA为模板,扩增hTRX编码蛋白的cDNA基因,并亚克隆至逆转录病毒载体pSIV-1中进行PCR、双酶切和测序鉴定。结果 将所得的序列与GenBank(BC003377)报道的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)与已知序列一致,第132、136、170、264位碱基与已知序列不同,其中第136、170位相应密码子编码的氨基酸发生了变化(Phe→Leu,Ile→Thr),成功获得了pSIV-1-hTRX重组逆转录病毒载体。结论 hTRX基因的克隆及其重组逆转录病毒载体pSIV-1-hTRX的构建,为进一步探讨hTRX的生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
17.
目的研究不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细袍的毒性及其影响细胞增殖的因素。方法采用组织块培养法体外原代培养鼠胚表皮细胞,用直接接触法和浸提液法体外培养鼠胚表皮细胞,MTT比色法检测其在不同蚕丝蛋白材料上的增殖活力和细胞相对增殖率,进行毒性分析;并用活细胞计数法观察不同蚕丝蛋白材料对鼠胚表皮细胞生长的影响。结果鼠胚表皮细胞在1、2、4、5、7、8、10号各型蚕丝蛋白材料上生长,其增殖活力与细胞对照组相当(P〉0.05);在3、6、9号化学交联或HY-823交联型蚕丝蛋白材料上生长,其增殖活力均低于细胞对照组(P〈0.05);而在11号蚕丝蛋白材料其增殖活力显著低于细胞对照组(P〈0.01)。1、7号丝胶材料细胞毒性分级为0级(无毒),2、3、4、5、6、8、9、10号各型蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为1级(轻微毒),而11号蚕丝蛋白材料细胞毒性分级为2级(中度毒)。活细胞计数结果与MTT检测结果基本相一致。结论除11号蚕丝蛋白材料外,1~10号各型蚕丝蛋白材料无明显细胞毒性,能支持鼠胚表皮细胞正常生长,具有良好的细胞相容性。 相似文献
18.
人IL-24基因在CHO细胞中的表达及其抗肿瘤效应 总被引:6,自引:2,他引:6
目的构建人IL-24基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-24的抗肿瘤活性。方法将测序验证的人IL-24基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组真核表达载体pcDNA3-hIL-24,转染CHO细胞进行稳定表达,经RT-PCR鉴定后用MTT法、Ho-echst染色和流式细胞术检测CHO细胞表达的rhIL-24诱导A549人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应,用ELISA检测其刺激免疫细胞分泌IL-6和IFN-γ的功能。结果经双酶切和PCR鉴定,重组真核表达载体构建正确,人IL-24在CHO细胞中获得稳定表达,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达IL-6和IFN-γ的免疫刺激活性。结论人IL-24基因的稳定表达和抗肿瘤效应的实验研究,为进一步研究人IL-24抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。 相似文献
19.
目的 克隆人白细胞介素-17F基因,并构建含有该目的基因的重组原核表达载体,获得高效表达hIL-17F的基因工程菌。方法 利用RT-PCR法,以PHA活化的人外周血单个核细胞的总RNA为模板,扩增出hIL-17FFeDNA的编码序列,并分别亚克隆至pUCm-T载体和原核表达载体pGEX.5X-3中,进行PCR、酶切鉴定和DNA序列测定。将重组原核表达载体转化感受态大肠杆菌B121后经IPTG诱导表达获得包涵体融合蛋白,且Western印迹鉴定。结果 PCR产物大小及其单酶切鉴定均证明所克隆的基因是hIL-17F,DNA序列测定进一步证实与GeneBank报道的序列完全一致。成功构建了重组原核表达载体pGEX-5X.3/hIL-17F,并在大肠杆菌中获得高效表达,约占菌体总蛋白的55%,且Western印迹证实确为目的蛋白。结论 该基因系国内首次克隆,hIL-17F基因重组体的构建和在大肠杆菌BL21中的高效表达,为进一步探讨其生物学活性和应用奠定了基础。 相似文献
20.
背景:前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3.0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)。目的:进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF(Ad—VEGF165)转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。设计、时间及地点:对比观察细胞基因工程实验,于2007-11/2008—04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。材料:再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。方法:将Ad—VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞,以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。主要观察指标:通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响;ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。结果:再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达,但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降(P〈0.05)。再生丝素膜组Ad—VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达,并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高(P〈0.05),而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。结论:再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达,并促进血管生成素1基因的表达,而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。 相似文献