炎性小体在炎性衰老及老年性疾病发生中的作用

近年研究发现免疫炎症与衰老的发生有关.在机体衰老过程中,固有免疫反应被激活,导致机体出现一种低水平、慢性炎症状态,即炎性衰老（inflammaging）.炎性小体（inflammasome）是由细胞内感受分子如pattern recognition receptors（PRRs）与接头蛋白ASC及procaspase-1蛋白组装而成的高分子量多蛋白复合物,是固有免疫系统的重要组成部分.炎性小体能被多种外源性病原微生物或内源性危险信号分子激活,进而诱导caspase-1酶活化.     

高糖对人肾小管上皮细胞氧化应激及蛋白质损伤效应的实验研究

目的 探讨高糖对人肾小管上皮细胞(HKC)氧化应激及蛋白质氧化损伤的作用.方法 将体外培养的HKC分为3组:对照组、高糖短期处理组、高糖长期处理组.对照组葡萄糖浓度为5.5mmol/L,高糖处理组葡萄糖浓度为30mmol/L.高糖短期处理组分为6个时间点,即30min及1、6、12、24、48h高糖刺激组;高糖长期处理组为高糖连续刺激2个月.用活性氧(ROS)捕获剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯(CM-H2DCFDA)孵育各组细胞,通过流式细胞技术和激光共聚焦显微镜检测高糖处理后不同时间点HKC中ROS的荧光强度以反映细胞内ROS的水平,用共聚焦显微镜检测荧光探针JC-1的荧光强度来表示线粒体膜电位,用2,4-二硝基苯肼(DNPH)比色法测定细胞内蛋白质羰基含量的变化.结果 流式细胞技术和激光共聚焦显微镜检测显示,经高糖刺激后,HKC内ROS含量在1h时达高峰,随后逐渐降低;线粒体膜电位在高糖刺激后短时间内(1h)有增高,其后下降DNPH比色法显示,短时高糖刺激对细胞中蛋白质羰基含量影响不明显(P>0.05),高糖刺激2个月时蛋白质羰基含量与短时刺激相比明显升高(P<0.05).结论 高糖处理可使HKC细胞氧化应激增强,从而造成生物大分子蛋白质的损伤.     

高糖对衰老的影响及其分子机制研究现状

衰老是在正常情况下随着年龄的增加引起各个器官功能障碍并最终引起机体死亡的不可避免的过程.一般来说,与易衰老的物种相比,较长寿的物种或个体其能量代谢率较低~([1]).能量代谢主要包括糖、脂肪、蛋白质三大物质的代谢,而人体所需能量的70%是由糖的分解代谢提供.     

用物理学方法检定细菌性多糖菌苗的成分

流脑、肺炎、流感杆菌及伤寒多糖菌苗由于它们内在的结构异质性造成检定的困难。虽然用层析法可估计其分子量大小,但不能提供关于污染多糖的结构及型别情况。目前靠比色法检定结构与纯度以估计磷、氮、O-乙酰含量。     

基因打靶技术及其在生物医学中的应用

一、基因打靶的概念 利用细胞染色体ＤＮＡ可与外源性ＤＮＡ同源序列发生同源重组的性质,以定向修饰改造染色体上某一基因的技术叫基因打靶（ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）。它是 ８０年代后半期发展起来的一门按预期方式精细改造生物遗传信息的实验手段。基因打靶最常用的一种策略是通过同源重组使特定靶基因失活,以研究该基因的功能,称基因敲除（ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）;也可通过同源重组用一种基因替换另一种基因,以便在体内测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的,该…     

上调整合素连接激酶可抑制肾小管上皮细胞E-cadherin 表达

目的 研究上调整合素连接激酶（integerin-linked kinase,ILK） 对肾小管上皮细胞（human kidney tubular cells,HKC）E- 钙黏素（E-Cadherin） 表达的影响。肾小管上皮细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT） 在肾间质纤维化中发挥重要作用。E-Cadherin 是维持肾小管上皮细胞极性的关键蛋白。ILK 是调控上皮细胞转分化的重要蛋白,其作用机制目前还不清楚。方法 本研究中我们将ILK 转染到HKC 中过表达,然后用RT-PCR、Western blot 及免疫荧光方法观察了ILK 对E-Cadherin 表达及糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β） 活性的影响。进一步用磷酸化下游底物GSK-3β 抑制剂SB415286 观察对E-Cadherin 表达的影响。结果 ILK 过表达可以明显抑制E-Cadherin 表达, 增加GSK-3β 活性。用GSK-3β 抑制剂处理后可以下调E-Cadherin 的表达。免疫荧光显示ILK 过表达可使上皮细胞发生极性改变,E-Cadherin 表达下调。表明ILK 上调可通过激活GSK 抑制E-Cadherin 表达,进而诱导肾小管上皮细胞出现转分化表型。     

NaDC3过表达对人肾小管细胞能量代谢和活性氧产生的影响

目的:研究三羧酸循环中间代谢产物转运蛋白-高亲和力钠依赖性二羧酸转运蛋白(NaDC3)基因过表达对人肾小管细胞能量代谢与活性氧(ROS)产生的影响。方法:用重组NaDC3逆转录病毒载体感染人肾小管上皮细胞HKC。用Western blotting检测细胞中外源性NaDC3蛋白的表达水平。通过液体闪烁法测定细胞内同位素[3H]标记琥珀酸(NaDC3的转运底物)的浓度。分别用Clark电极法和反相高压液相法测定细胞内氧耗量和ATP含量。分别用荧光探针JC-1和CM-H2DCFDA处理细胞后通过激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位和细胞内ROS含量。结果:Western blotting结果显示导入外源NaDC3基因后可使细胞内NaDC3蛋白的表达水平明显增加。转运实验显示NaDC3病毒感染细胞内的[3H]-琥珀酸水平明显高于未感染和对照载体感染细胞。NaDC3病毒感染细胞中的氧耗量和ATP含量明显高于未感染和对照载体感染细胞。激光共聚焦检测显示,与未感染和对照载体感染细胞相比,NaDC3感染细胞的线粒体膜电位和ROS水平明显增加。结论:NaDC3过表达可通过转运过多的三羧酸循环中间代谢产物进入细胞内而加快肾小管上皮细胞能量代谢的速率、增加细胞内ROS的产生水平。     

重组腺病毒介导的p16INK4a表达诱导A549细胞衰老的研究

目的 构建E1区缺失的复制缺陷型5型重组腺病毒载体，探讨p16INK4a基因对肺癌细胞株A549细胞增殖与衰老的影响。方法 通过脂质体介导，将pAdCMV-p16INK4a与pJM17共转染人5型腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系293细胞，同源重组产生腺病毒空斑，用双重PCR筛选出携带p16INK4a基因的重组腺病毒并感染肺癌细胞A549，用免疫组化及Western blot检测腺病毒载体介导的基因转移效率和蛋白表达水平，分别用X-gal染色和TRAP-ELISA检测A549细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶及端粒酶活性。结果 腺病毒载体可将95％以上的p16INK4a基因转移到A549中，受感染细胞有外源p16INK4a蛋白表达，其生长受到明显抑制，即p16INK4a基因能诱导A549细胞表达衰老相关β-半乳糖苷酶，并抑制细胞中的端粒酶活性。结论 复制缺陷型重组腺病毒，能有效地介导外源基因的转移与表达，可用于基因免疫和基因治疗；p16INK4a基因能抑制肺癌细胞A549生长并诱导其发生复制性衰老。