用pIII及pVIII噬菌体展示系统展示抗原和抗原表位的免疫原性的研究

目的:探索用pIII和pVIII噬菌体展示系统展示抗原和抗原表位的免疫源性以及用噬菌体展示颗粒为免疫原制备抗体的可能性.方法:从人心肌组织中获得cTnI基因,突变后克隆入pMDT-18载体及pFD5 pIII型噬菌体展示载体.合成两条互补寡聚核苷酸单链,退火后变成编码cTnI 95～108位氨基酸的双链,与 PC89 pVIII型噬菌体展示载体连接.含有cTnI及其抗原表位基因的重组质粒转化辅助噬菌体敏感的XL1-Blue细胞,用VCSM13超感染获得展示有cTnI及其抗原表位的噬菌体颗粒,测定其表达量.并以此为免疫源免疫新西兰白兔获得抗体,用ELISA方法测定抗体滴度.结果:cTnI及其抗原表位在噬菌体颗粒表面得到成功展示,展示量分别为5 ng/ml和96 ng/ml.免疫后得到的抗体滴度为1∶300和1∶1?800.结论:制备具有一定空间结构的大分子蛋白的抗体时,可用pIII噬菌体展示系统,制备小分子肽线性表位的抗体时,pVIII展示系统具有独特的优势.     

噬菌体展示载体的构建

目的 构建适宜噬菌体展示的载体系统。方法 利用pCOMB3的LacZ强启动子，Pelb引导序列，包膜蛋白Ⅲ基因，用NHeI-XbaI双酶切，切除一个克隆位点；同时设计一对引物，用PET-28（a)^ 作模板扩增550bp片段，插入XhoI-SpeI位点之间，扩增质粒后用限制性内切酶，PCR，DNA测序等方法作鉴定。结果 切除了272bpNHeI-XbaI片段。插入片段后酶切鉴定显示：XhoI,SpeI单酶切，XbaI,NheI无酶切；所构质粒用XhoI SpeI双酶切及PCR扩增均可见550bp片段；测序结果正确。结论 成功构建了一种高拷贝，稳定，多用途，易于操作的噬菌体展示载体。     

瑞替普酶(reteplase)在海带中表达的鉴定分析

为验证本实验室构建的瑞替普酶（reteplase，r-PA）基因是否成功转入海带，本文通过FAPA、PCR、Southern blotting和Western blotting等方法分别从体外纤溶活性、DNA的整合以及目的蛋白的表达等三个方面进行鉴定，并运用固定化金属离子亲和层析对表达的蛋白进行了初步分离纯化。FAPA结果表明转基因海带蛋白具有溶栓活性，PCR和Southern Blotting显示在1100bp处有特异性条带，Western blotting在39ku处有蛋白条带，证明r-PA基因已成功转入海带而且获得稳定表达，海带中表达的r-PA不需复性就具有溶栓活性，同时说明在r-PAN端设计的（His）6有助于我们利用亲和层析分离纯化目的蛋白。     

雌二醇霜剂透皮吸收示踪研究

用3H-E2作示踪剂,对雌二醇(E2)霜剂的透皮吸收速率和生物利用度进行了研究.霜剂小鼠离体皮肤渗透速率为3.80ng·cm-2·h-1;小鼠在体内透皮吸收速率,6h内平均为4.72 ng·cm-2·h-1;与大白鼠静注给药相比,霜剂经皮给药的生物利用度为25.5%.     

东莨菪碱透皮控释膜剂的研究

本文研制了东莨菪碱透皮控释膜剂。采用自行设计的体外扩散装置,分别研究了药库、含药压敏胶和复合膜等各层次及控释膜剂的体外释药速率,该制剂在最初4h释放初始剂量约200μg。达到稳态释放阶段后(4～72h),由控释膜控制其释药速率为2.8μg/cm~2·h。用大鼠离体皮肤研究渗透速率,药物以零级速率经皮渗透,0～12h内渗透速率为3.52μg/cm~2·h。     

蛇毒纤溶酶的体内过程及药物代谢动力学研究

以１２５Ｉ－蛇毒纤溶酶作示踪剂对蛇毒纤溶酶的体内过程及药代动力学进行了研究。实验结果表明，静脉注射后，大鼠体内血药浓度时程曲线为二房室模型，Ｔ１／２β分别为６．１ｈ（低剂量），６．３ｈ（中剂量）和５．６ｈ（高剂量）。小鼠尾静脉注射后３ｈ，各脏器中放射性活性达到峰值，其值（％）大小顺序如下：肾（１．３４）＞肺（（１．０９）＞肝（０．９０）＝脾（０．９０）＞心（０．５１）＞肌肉（０．４５）＞脑（０．２９）。１２５Ｉ－蛇毒纤溶酶主要从尿排泄，静脉注射后，７２ｈ内尿排泄率达８５．６％，而粪排泄仅为５．４％，胆汁排泄率为１２％。     

重组人瑞替普酶基因在山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因座的定点整合

目的:利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶(rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株.方法:构建了针对山羊β-酪蛋白基因座的定点打靶载体,其上游同源臂为β-酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约6.1 kb的基因组片段,下游同源臂为3.3 kb从β-酪蛋白外显子6至外显子9的基因组片段.rPA小基因起始密码子位于β-酪蛋白信号肽编码区下游.将载体瞬时转染C127小鼠乳腺癌细胞,并通过激素进行诱导,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测细胞培养上清中的rPA表达量来验证载体表达功能.将载体通过电穿孔的方法转染同基因型的山羊胎儿成纤维细胞.利用G418和GANC进行药物筛选,并通过PCR和southern杂交的方法进行基因组DNA检测.结果:获得了一株定点整合的细胞克隆,绝对基因打靶效率为2×10-7.结论:本实验结果为后续利用核移植技术制备乳腺生物反应器提供了坚实的实验基础.     

重组人干扰素α2b表达与分离纯化研究

目的从湿菌体中分离纯化重组人干扰素α2b。方法采用(NH4)2SO4盐析-H3PO4处理-CM32离子交换层析-DE52离子交换层析-Sephadex G100凝胶层析等非亲和层析纯化方法。结果回收率约为30%,HPLC检验纯度达96%,每毫克蛋白比活力达1.66×108IU。结论分离纯化系统令人满意,回收率较高。     

聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化和制备

目的建立聚乙二醇修饰干扰素α2b的分离纯化方法.方法运用Superdex75Highload制备型凝胶色谱柱,以含0.15mol/LNaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱,流速为1.5ml/min,检测波长为215nm.结果各洗脱组分经SDS-PAGE检测呈单一条带.聚乙二醇修饰干扰素α2b的蛋白回收率为36.5%,抗病毒活性回收率为4.3%,比活度为4.74×10\+7IU/mg,是原形干扰素α2b的10.4%.结论这种方法可以用于制备聚乙二醇修饰干扰素α2b.     

59Fe-玉米多糖铁复合物在大鼠体内吸收、分布及排泄研究

目的建立血浆中玉米多糖铁（corn polysaccharide iron complex, CPIC）浓度的测定方法,并对玉米多糖铁在大鼠体内的
吸收、分布和排泄过程进行研究。方法SD大鼠灌胃（28、14、7 mg/kg）给予59Fe-玉米多糖铁后,采用放射性同位素示踪法测定
不同时间点大鼠血浆中59Fe-玉米多糖铁的放射性,所得数据用DAS软件求算药动学参数并分析59Fe-玉米多糖铁在大鼠体内的
组织分布和排泄。结果当59Fe-玉米多糖铁中铁离子的浓度在0.14~141 μg/ml的浓度范围内时,其线性关系良好,r=0.9999（n=
5）。平均回收率达到95%以上、RSD值低于15%。其主要药代动力学参数在三个剂量组的t1/2分别是214±104、231±110、181±
81 min,AUC(0-∞)分别为1986.3±513.3、737.0±467.0、315.1±226.1 mg·min-1·L-1。在所测的13种组织中均有分布,但在胃肠道
和造血器官及血流丰富器官中放射性浓度最高。大鼠口服59Fe-玉米多糖铁后主要通过粪便排出体外。结论用同位素示踪法
测定血浆中59Fe-玉米多糖铁浓度,方法简单,专属性强,药动学参数表明其在大鼠体内的药动学模型符合二室模型。