微柱凝胶法交叉配血试验次侧凝集原因分析

微柱凝胶法交叉配血是近年来全国各大医院输血科普遍使用的一项免疫分析方法。不仅可以检出IgM类血型抗体,也可检出IgG类不完全抗体,大大降低了溶血性输血反应的发生。但该方法在配血过程中常出现次侧凝集现象,若不能快速作出正确合理的分析和处理,则会影响临床输血的及时性和安全性。本文对本院使用微柱凝胶法交叉配血出现次侧凝集的病例进行分析,发现可能与受血者本身的疾病有一定关系,报告如下。     

几种线粒体DNA提取方法的比较

目的将提取线粒体DNA的碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线粒体DNA的方法.方法采用健康成年雄性Wistar大鼠,取回肠上皮细胞样本18份,每份含3×10?6细胞,每6份分别用碱变性法、Triton法、改进高盐沉淀法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量.再用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase6亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA.结果3种方法提取线粒体DNA量差别明显改进高盐沉淀法量最多,为(1.26±0.23)μg;碱变性法次之,为(0.52±0.18)μg;Triton法为(0.31±0.16)μg.A260/A280均大于1.7.说明改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,产量多的优点.将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列,说明该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序.讨论和结论线粒体在细胞凋亡,衰老及程序化死亡中发挥重要作用.已在多种疾病中发现mtDNA突变.对线粒体疾病的分子遗传机理的研究可以进一步阐明这些疾病的病因,并为治疗提供理论指导.胡义德、Tamura和Palva等用碱变性法提取了人血白细胞、心肌等组织中mtDNA;戴纪刚等建立的Triton法先除去细胞核,再分离提取胞浆中mtDNA.而高盐沉淀法通过SDS(十二烷基硫酸钠)破坏细胞膜、核膜,使蛋白质变性,从而游离出核酸,EDTA抑制细胞中DNA酶的活性,蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽,加入饱和乙酸钠后,绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SDS作用下变性形成沉淀,环状mtDNA仍为自然状态,通过高速离心,即可得到mtDNA.3种方法各有优缺点碱变性法操作时间较短,要求条件比较严格,不易重复;Triton法通过核质分离提取mtDNA操作时间短,但产量低,易降解.而高盐沉淀法操作简单,易重复,产量多,可依需用量扩大反应体系,使mtDNA质量得以容易控制.     

失血性休克肠上皮细胞线粒体形态与功能变化的研究

目的定量分析大鼠失血性休克肠上皮细胞线粒体形态与功能的改变,探讨失血性休克缺血缺氧时肠上皮细胞线粒体结构和功能的改变。方法Wistar大鼠随机分为对照组、失血性休克2h和5h组,采用计量电镜法观察、生物体视学测量线粒体形态,用clark氧电极测线粒体呼吸功能。结果失血性休克2h,线粒体平均截面周长、长径、平均直径及其面密度、体密度分别较对照组增加24%、27%、25%、26%、44%,失血性休克5h,平均截面面积、周长、长径、短径、平均直径及其面密度、体密度分别较对照组增加100%、45%、45%、50%、45%、47%、122%,嵴和基质破坏明显。休克2h组线粒体比表面与正常组比较下降14%。休克5h组线粒体比表面和数密度与对照组比较分别下降32%、24%。休克2h、5h组线粒体呼吸控制率（RCR）与对照组比较均有显著性改变,休克5h组线粒体呼吸控制率比对照组减少32%。结论和讨论失血性休克时大鼠肠上皮细胞线粒体形态发生显著改变。对休克大鼠肠线粒体形态学改变的定量分析表明,休克发生发展过程中,线粒体形态主要改变是,线粒体截面积、周长、长径、短径、平均直径、面密度、体密度、比表面显著增加,数密度下降。定量说明休克缺血缺氧时肠上皮细胞线粒体肿胀发展较快。休克2h后,线粒体膜尚完整,部分线粒体嵴紊乱,有髓样小体、小空泡形成。休克5h后,线粒体显著肿胀,嵴不规则、溶解、断裂和消失,在有嵴存在的线粒体,嵴内腔扩大较2h重,可见较大空泡形成。休克5h线粒体数量明显减少。形态变化是功能改变的基础,体视学方法准确反映了休克时线粒体形态变化过程。 呼吸控制率是表达线粒体功能最灵敏的指标。休克2h后,线粒体呼吸控制率已开始下降,至休克5h已下降32%,说明线粒体状态已明显改变,合成ATP能力下降。线粒体为细胞能量代谢的重要细胞器,三羧酸循环位于基质内,电子传递链和氧化磷酸化的部位在内膜,两者紧密相连。线粒体的结构与其呼吸功能及能量合成功能密切相关。嵴和基质的破坏,引起线粒体三羧酸循环破坏,电子传递受阻,氧摄取困难,加上基质内pH改变,ATP合成酶数量减少,这些因素都影响了线粒体合成ATP的功能。线粒体对缺血缺氧非常敏感,是细胞损伤最早累及的细胞器之一,是细胞保护的重点。保护线粒体,消除细胞内能量代谢障碍,可减轻细胞损伤。预防休克后肠屏障功能破坏对继发的脓毒血症、MODS有重要意义。     

失血性休克大鼠小肠上皮细胞线粒体ATPase8亚基表达的变化

目的探讨正常与休克大鼠小肠上皮细胞线粒体DNA（mitochondria DNA,mtDNA）ATPase8亚基及其表达的变化,为休克的防治提供理论基础。方法用透射电镜观察大鼠小肠上皮细胞线粒体形态学变化,用基因重组、测序,通过gene Bank与mtDNA已知序列进行比较,研究大鼠小肠上皮细胞mtDNA ATPase8基因的改变。用RT-PCR观察大鼠小肠上皮细胞线粒体ATPase8 mRNA的表达。结果休克组大鼠小肠上皮细胞线粒体数密度和面密度与对照组相比有显著差异（P〈0.05或P〈0.01）。正常组小肠上皮细胞mtDNA ATPase8亚基9个DNA测序有2处突变（A7868G,空7767-7768G）。休克组有3处突变,即A7797空,T7772C、T7863C。失血性休克组大鼠上皮细胞线粒体ATPase8 mRNA表达比正常组显著性下降（P〈0.05）,为对照组的27.3%。结论休克大鼠小肠上皮细胞mtDNA ATPase8基因突变以及表达水平下降是导致ATPase8亚基改变的重要原因。     

慢性阻塞性肺疾病急性加重合并呼吸衰竭患者血清环氧化酶2和前列腺素E2及磷脂酶A2水平的变化及其临床意义

目的 观察慢性阻塞性肺疾病急性加重合并呼吸衰竭患者血清环氧化酶2、前列腺素E2和磷脂酶A2水平变化及意义.方法 选取河北省涿州市医院2011年12月至2012年12月100例慢性阻塞性肺疾病急性加重患者,完全随机分为无呼吸衰竭组（50例）和呼吸衰竭组（50例）,另选择20例健康查体者作为健康对照组.观察3组患者血清环氧化酶2、前列腺素E2和磷脂酶A2的变化.结果 呼吸衰竭组和无呼吸衰竭组血清环氧化酶2、前列腺素E2和磷脂酶A2浓度明显高于健康对照组[（158±45）、（132±12）μg/L比（57±12）μg/L,（317±213）、（207±30）ng/L比（103±18）ng/L,（28.2±1.5）、（20.2±1.4）μg/L比（7.0±2.4）μg/L],差异均有统计学意义（均P＜0.05）.呼吸衰竭组血清环氧化酶2、前列腺素E2和磷脂酶A2浓度与无呼吸衰竭组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.呼吸衰竭组血清环氧化酶2、前列腺素E2水平与磷脂酶A2水平呈正相关（r分别为0.406、0.356,P＜0.05）;血清环氧化酶2水平与前列腺素E2水平呈正相关（r为0.848,P＜0.01）.结论 慢性阻塞性肺疾病急性加重合并呼吸衰竭患者血清环氧化酶2、前列腺素E2和磷脂酶A2的浓度明显升高,血清环氧化酶2、前列腺素E2和磷脂酶A2三者之间相互关联并相互作用,共同导致呼吸衰竭的发生和发展.     

灯盏花素对大鼠肝纤维化分泌型磷脂酶A2和细胞因子的影响

目的探讨灯盏花素通过抑制分泌性磷脂酶A2(sPLA2)及其相关细胞因子对肝纤维化的影响。方法将健康雄性Wistar大鼠18只随机分为3组:灯盏花素组、CCl4模型组及对照组各6只。PBS灌胃作为对照组;5%CCl4橄榄油按5ml/kg灌胃,每3天1次共15次,作为CCl4模型组;每次CCl4灌胃同时腹腔注射灯盏花素5mg/kg,作为灯盏花素组。于预定时间处死大鼠,对大鼠肝脏分别进行HE染色、电镜观测、sPLA2免疫组化,并且检测大鼠血清sPLA2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、血清Ⅲ型前胶元(PCⅢ)和透明质酸(HA)水平。结果灯盏花素组胶原纤维、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HA及PCⅢ水平高于CCl4模型组,CCl4模型组高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。灯盏花素组第2周、第4周、第6周时PGE2、TNF-α及sPLA2水平低于CCl4模型组,CCl4模型组高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。灯盏花素组sPLA2阳性细胞数为(10.2±3.5)个/mm2少于CCl4模型组的(37.2±7.3)个/mm2,CCl4模型组多于对照组的(1.3±0.8)个/mm2,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论灯盏花素具有抗肝纤维化作用,其作用机制与抑制sPLA2、TNF-α、PGE2水平相关。     

三七皂甙Rg1对脂多糖诱导的大鼠肝细胞损伤的防护作用

目的探讨脂多糖诱导大鼠肝细胞的损害特点,并探讨三七皂甙Rg1抗肝细胞损害的保护作用。方法用胶原酶灌流法分离肝细胞。脂多糖诱导大鼠肝细胞损害,透射电镜观察肝细胞形态学的变化,DNA凝胶电泳观察其生化变化,用单细胞凝胶电泳法(SCGE)进一步探讨肝细胞损害的特点,并探讨三七皂甙Rg1对肝细胞损害的保护作用。结果由脂多糖诱导的肝细胞在形态上表现出染色质凝聚、凋亡小体形成等凋亡特征,生化方面表现出典型的DNA梯度,此过程可被凋亡抑制剂Quinaceine抑制。用SCGE法检测出,肝细胞凋亡和死亡数量与脂多糖的诱导时间有明显的相关性。在此基础上,观察到三七皂甙Rg1可抑制肝细胞凋亡和坏死,其抑制效果与Quinaceine无明显差异。结论三七皂甙Rg1可显著抑制肝细胞凋亡和坏死,是防治肝细胞损害的良好药物。     

三七皂甙Rb1对急性呼吸衰竭大鼠的影响及作用机制的研究

目的探讨三七皂甙Rb1对急性呼吸衰竭大鼠肺脏线粒体功能的影响及作用机制。方法将Wistar大鼠随机分为4组,分别为对照组、呼吸衰竭模型组、Rb1治疗1组(低剂量组5 mg/kg)、Rb1治疗2组(高剂量组10 mg/kg),每组10只。采用舌静脉注射内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)复制大鼠急性呼吸衰竭模型,于大鼠急性呼吸衰竭3小时后,迅速取出大鼠肺脏,低温差速离心法提取肺脏组织线粒体,用荧光偏振法检测肺脏线粒体膜的流动性和膜的微粘度。用RT-PCR测定细胞色素氧化酶ⅡmRNA表达的变化,用[3H]油酸标记的大肠杆菌作为底物,测定呼吸衰竭大鼠分泌性磷脂酶A2活性的变化。结果大鼠呼吸衰竭肺脏线粒体膜的流动性下降,呼吸衰竭组线粒体膜细胞色素氧化酶Ⅱ基因表达增强,2小时达高峰。分泌型磷脂酶A2活性1小时增强,5小时达高峰,三七皂甙Rb1低剂量组(5 mg/kg)可使线粒体膜流动性下降,细胞色素氧化酶ⅡmRNA表达增强,三七皂甙Rb1高剂量组(10 mg/kg)与模型组相比有统计学意义(P0.01)。结论三七皂甙Rb1对呼吸衰竭有保护作用(P0.05),其中高剂量组对呼吸衰竭大鼠有显著的保护作用(P0.01)。     

三七皂甙Rg1、Rb1抗大鼠肝纤维化的作用及机制研究

目的探讨三七皂甙Rg1、Rb1对肝纤维化大鼠线粒体的保护作用及机制。方法将大鼠随机分为4组,分别为对照组、模型组、Rg1、Rb1保护组,用5％CCl4橄榄油胃饲复制大鼠肝纤维化模型,用透射电镜和光镜观察肝细胞形态学变化。用放射免疫法检测Ⅲ型前胶原（ procollagen type Ⅲ,PCⅢ）的水平。用[3H]油酸标记的生物膜法测定肝线粒体分泌型磷脂酶A2（secretory phospholipase A2,sPLA2）活性,用分光光度法测定肝线粒体MDA含量,SOD活性,Ca2＋-ATP酶,总ATP酶活性,用荧光偏振法测定肝线粒体膜的流动性,紫外分光光度法测定呼吸链复合体Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的活性。结果组织学用电镜检测可见模型组细胞有粗大束状的胶原纤维沉淀。 HE染色和Masson胶原染色切片统计分析得出Rg1、Rb1组的纤维化程度与对照组比较有统计学意义（ P ＜0噜．01）。血清学检查显示Rg1、Rb1组显著抑制血清中ALT、PCⅢ的升高,提高线粒体SOD活性,降低MDA含量,抑制sPLA2的升高,提高线粒体膜Ca2＋-ATP酶活性,总ATP酶活性（ P ＜0．01）;生物物理学证实Rg1、Rb1组增加线粒体膜的流动性,降低膜的微粘度,显著增加呼吸链复合体Ⅲ,Ⅳ的活性（ P ＜0．01）。结论三七皂甙Rg1、Rb1通过对肝纤维化大鼠线粒体显著的保护机理而起到抗肝纤维化的作用。