携带DREAM基因shRNA的慢病毒载体的构建及其对坐骨神经缩窄损伤大鼠的镇痛作用

目的：构建含下游调控元件的拮抗分子（downstream regulatory element antagonistic modulator,DREAM）基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体, 利用RNA干扰技术抑制DREAM基因表达,开展对神经病理性疼痛基因治疗的实验研究。方法：将靶向大鼠DREAM基因的shRNA重组到慢病毒穿梭质粒中,将重组质粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包装系统共转染293T细胞包装成慢病毒,收集病毒上清并进行载体病毒滴度的测定。将纯种健康清洁级成年雄性SD大鼠36只随机分为6组: 正常对照组(N)、假手术组(S),根据干预手段的不同将大鼠坐骨神经缩窄损伤（chronic constriction injury of sciatic nerve, CCI）模型组分为4组:CCI(C0)组, CCI疼痛模型建立后不给任何干预措施,生理盐水对照（C1）组,空白载体对照（C2）组,LV-shRNADREAM慢病毒载体治疗（C3）组。该3组大鼠于CCI后第7天分别于蛛网膜下腔注射生理盐水、空白载体、LV-shRNADREAM慢病毒载体。观察各组大鼠术后3,7,10,14,21 d的疼痛行为学的改变。实验结束取腰段脊髓荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Realtime-PCR测定DREAM基因的mRNA 含量、Western印迹测定DREAM 蛋白含量。结果：测序分析证实载体构建成功,成功进行慢病毒包装,得到病毒液滴度为1.0×108 IFU/mL慢病毒载体。鞘内注射LV-shRNADREAM慢病毒载体后, CCI大鼠热痛阈和机械痛阈的异常明显得到改善（P<0.01）, 腰段脊髓神经细胞DREAM基因mRNA和 DREAM蛋白的表达均显著降低（P<0.01）。结论：成功构建了携带大鼠DREAM基因有效shRNA的慢病毒载体,慢病毒携带的短发夹干扰ＲＮＡ能干扰脊髓中DREAM的表达,为神经病理性疼痛的治疗提供了实验基础。     

MicroRNA-539靶向调控E2F转录因子3抑制肝癌的发生与发展

目的 探讨肝癌组织中microRNA-539（miR-539）表达水平及其抑制肝癌细胞增殖的作用机制。方法 收集90例肝癌患者术后肝癌组织及癌旁组织标本,用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测组织中miR-539表达量。在PCL/PRF5、Huh7和QGY-7701肝癌细胞中转染miR-539 模拟物（mimics）,用Real-time PCR检测miR-539表达量。用MTT法检测miR-539对肝癌细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测miR-539对肝癌细胞凋亡的影响;用免疫印迹法检测miR-539对肝癌细胞中E2F转录因子3（E2F3）蛋白表达的影响。结果 肝癌组织中miR-539表达量显著低于癌旁组织（P<0.05）;miR-539表达量与肝癌患者性别、年龄及肝癌组织分化程度无关（P>0.05）;与肿瘤直径和淋巴结转移相关（P<0.05）。转染miR-539 mimics组肝癌细胞中miR-539表达量显著高于空白组和miR-539 NC组（P<0.05）。在QGY-7701细胞中,过表达miR-539能显著抑制细胞增殖（P<0.05）,降低E2F3蛋白的表达（P<0.05）,对细胞凋亡无明显作用（P>0.05）。结论 miR-539是肝癌发生中的抑癌因子,可能是通过靶向下调E2F3蛋白水平达到抑制癌细胞的增殖。     

淋病奈瑟球菌表面蛋白A基因疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

目的构建淋病奈瑟球菌表面蛋白A（NspA）基因疫苗，并接种小鼠，评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法将NspA基因插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／NspA，并经PCR、双酶切及测序鉴定。反转录一聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法分别检测NspA基因转染细胞后mRNA和蛋白的表达。以pcDNA3．1（＋）／NspA重组质粒免疫45只雄性BALB／c小鼠，试管凝集法检测免疫小鼠抗体滴度，ELISA检测IFN-γ水平，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测脾淋巴细胞增殖。提取接种部位股四头肌总DNA，PCR检测BALB／c小鼠肌细胞内NspA基因。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／NspA基因疫苗，能在真核细胞中转录和表达。pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组的抗体滴度达1：640，pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组均无特异性抗体检出。空载体pcDNA3．1（＋）组IFN-γ为（23．79±11．85）pg／mL，pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组为（169．71±30．52）pg／mL（P〈0．01）；脾淋巴细胞增殖的刺激指数（SI）分别为1．05±0．30和1．94±0．74（P〈0．01）。并证实NspA基因可在小鼠肌细胞中稳定存在。结论构建淋病奈瑟球菌NspA基因疫苗，将其免疫BALB／c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答，为进一步用于淋病预防奠定了基础。     

SV40LT基因重组腺病毒载体的包装、鉴定及用于转染日本血吸虫童虫细胞的研究

目的构建携带SV40LT基因的重组腺病毒表达载体,制备具有感染力的重组腺病毒,观察其转染日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj）童虫细胞后的表达情况。方法采用体外连接法构建好的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒（AdHu5-SV40LT）转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒后,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,获得出重组腺病毒（AdHu5-SV40LT）。将重组腺病毒感染Sj童虫细胞,采用RT-PCR和免疫组织化学检测SV40LT基因的表达情况。结果重组腺病毒载体质粒可转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制;提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因。以重组腺病毒能感染Sj童虫细胞,经RT-PCR和免疫组化检测有SV40LT基因在细胞中的表达。结论成功包装了具有感染能力的含SV40LT基因的重组腺病毒,感染Sj童虫细胞后目的基因有表达,为进一步探索日本血吸虫细胞永生化提供了实验依据。     

日本血吸虫童虫细胞与免疫调节剂联用诱导小鼠免疫保护性效果观察

目的观察单用日本血吸虫（SJ）童虫细胞（SC）和联用免疫调节剂诱生小鼠免疫保护性的效果。方法制备感染后第18dSC;实验昆明小鼠分为8组：A组（PBS）、B组（SC）、C组（IL-2）、D组（IL-2＋SC）、E组（IFN-γ）、F组（IFN-γ＋SC）、G组（香菇多糖）、H组（香菇多糖＋SC）。腹股沟皮下间隔2w免疫1次,共3次。于末次免疫第4w攻击感染,第35d后剖杀小鼠计数虫荷及每克肝卵数（LEPG）,计算减虫率和LEPG减少率。ELISA测定第2、3次免疫后及攻击前小鼠血清中特异性抗童虫可溶性抗原（SWSA）的抗体。结果保护性效果显示：与A组比较,B、C、D、E、F、G和H组的减虫率分别为43.3%、13.5%、36.1%、32.7%、46.2%、18.3%和33.7%,LEPG减少率分别为59.8%、26.6%、52.1%、47.7%、57.7%、34.0%和53.7%。各免疫调节剂与SC联合免疫组与单用SC组比较,特异性抗体水平差异无统计学意义。结论SC能诱生小鼠较明显的免疫保护性,单用IFN-γ也有一定的减虫和减卵效果,但免疫增强剂均未能显著提高SC诱生的免疫保护性效果和体液免疫应答水平。     

经伤椎固定治疗骨折-脱位型胸腰椎损伤11例

骨折脱位是胸腰椎损伤中严重的一种类型,常伴脊髓损伤.新鲜骨折既往常选择行后路减压、短节段经椎弓根4枚螺钉固定.但该类损伤脊柱稳定性结构严重破坏,跨越伤椎内固定存在较大程度的不可靠性,常常复位不满意或达不到复位要求,出现平行四边形效应.2006年7月至2009年11月,我们采用椎弓根6枚螺钉固定(同时对伤椎固定)治疗骨折一脱位型胸腰椎损伤11例,获得良好的临床效果,报告如下.     

自拟疏风利肺汤治疗咳嗽变异性哮喘的临床研究

目的 观察疏风利肺汤对咳嗽变异性哮喘（CVA）（风痰恋肺证）的临床疗效.方法 将100例患者随机分为两组,治疗组口服疏风利肺汤,对照组吸入沙美特罗氟替卡松粉吸入剂,两组疗程均为4周.结果 治疗组咳嗽改善情况优于对照组（P＜0.05）;中医症候方面治疗组疗效优于对照组（P＜0.05）;气道反应性比较,治疗组改善优于对照组（P＜0.05）;两组生活质量均较治疗前改善（P＜0.05）,组间比较,治疗组生活质量总分优于对照组（P＜0.05）.结论 疏风利肺汤治疗CVA患者（风痰恋肺证）疗效确切,能有效改善患者的临床症状、生活质量,且疗效优于对照组,并能降低气道反应性.     

丙泊酚复合雷米芬太尼在乳腺区段切除术中的应用

目的观察丙泊酚复合不同靶控浓度雷米芬太尼对乳腺区段切除手术麻醉效果和术后恢复的影响。方法 60例择期行乳腺区段切除手术的患者,随机均分为R1、R2、R3组,雷米芬太尼的靶控浓度分别为2、4、6ng/ml,丙泊酚靶控浓度为4μg/ml。记录丙泊酚用量、血流动力学、BIS值、术中肢动及术后恢复情况。结果 R2、R3组患者意识消失时间和喉罩置入时丙泊酚总用量明显少于R1组(P0.05)。喉罩置入前、后和切皮后R2、R3组的MAP、HR较R1组明显下降和减慢(P0.05);R1组术中肢动的反应和丙泊酚用量明显高于R2、R3组(P0.05);手术结束后自主呼吸恢复时间、呼之睁眼时间、拔除喉罩时间、定向力恢复时间、以及苏醒后VAS评分、恶心呕吐发生率三组间差异均无统计学意义。结论在乳腺区段切除手术中,靶控输注4μg/ml丙泊酚复合大于4ng/ml的雷米芬太尼可以取得满意的麻醉效果,且术后恢复迅速。