活性依赖性神经保护蛋白同源基因在帕金森病模型鼠脑中的表达

帕金森病 (PD)是以震颤、强直、运动迟缓为特征的中枢神经系统疾病 ,主要病理变化为黑质致密部多巴胺能神经元变性。PD是中老年人常见的致残疾患 ,备受关注。近年发现将活性依赖性神经保护蛋白 (ADNP)加入神经细胞培养基中 ,可抵御某些毒性物质对神经细胞的伤害 ;在小鼠及大鼠体内实验亦显示有预防脑损伤作用〔1〕。我们于2 0 0 1年 6月至 2 0 0 2年 4月制备类似PD症状的大鼠模型 ,旨在探讨ADNP的表达量与PD病变有无关系。　　一、材料与方法　　 1.PD样脑损伤动物模型的建立 :7周龄雄性C5 7BL小鼠 10只 (本校动物中心提供 ) ,实验…     

利用消减抑制杂交技术构建MPTP诱导的C57BL小鼠全脑差异表达基因文库

本研究旨在构建1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的C57BL小鼠全脑差异表达基因文库,并获取差异表达的表达序列标签.通过MPTP腹腔注射建立C57BL小鼠帕金森病模型.利用消减抑制杂交技术建立对照组与实验组差异表达基因文库.自两文库中各随机挑选20个克隆,经反Northern杂交证实其中7个克隆为阳性.同时对上述40个克隆进行序列测定,并与已知序列基因库进行同源性比较,其中26个新基因片段向Genbank申请了序列号.     

新生大鼠小脑内发育相关基因的筛选

为筛选脑发育相关的基因 ,应用新发展的抑制消减杂交技术 ,以新生大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为测试者 (tester) ,成年大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为驱动者 (driver) ,进行消减杂交 ,克隆制备成新生大鼠小脑高表达的cDNA文库。挑选出 5 0个重组质粒 ,测序得到 37个不同基因片段序列。再次用反Northern杂交确认有意义的差异表达基因。同时将测序结果与GenBank注册序列进行同源性比较 ,2 0个大鼠中首次测得的基因表达序列标签 (EST)已被GenBank收录 (BG6 95 72 6 -BG6 95 74 5 )。     

淀粉样蛋白对大鼠海马神经元驱动蛋白超家族基因表达的影响

目的:探讨淀粉样蛋白脑室注射对大鼠皮层与海马神经元驱动蛋白超家族(KIF)基因表达的影响。方法:脑室定向注射淀粉样蛋白复制大鼠阿尔兹海默病动物模型,水迷宫实验验证大鼠记忆损伤程度。RT-PCR方法检测大鼠皮层与海马ChAT、KIF1A、KIF2、KIF3A、KIF4与KIF5A基因的表达。结果:水迷宫实验与ChAT表达检测证实动物模型复制成功。RT-PCR结果表明淀粉样蛋白造成大鼠皮层与海马KIF基因表达的普遍上升。结论:淀粉样蛋白造成的皮层与海马胆碱能神经元损伤很可能是通过其兴奋性毒性作用实现的。     

大鼠视觉相关脑区表达序列标签的克隆与鉴定

目的分析视觉相关脑区基因的差异表达并获取新的表达序列标签.方法利用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术分析大鼠外侧膝状体与视皮层基因差异表达情况,并筛选差异表达基因片段.结果经DDRT-PCR筛选并通过反Northern杂交去除假阳性,最终获得1个差异表达基因片段.对其进行克隆、测序和同源性比较发现,该片段为一新的表达序列标签,并与心肌细胞集钙蛋白的mRNA具有74%的同源性.结论视觉相关脑区差异表达序列的分析可能为研究视觉形成的分子机制或视觉通路的分子构筑提供有益的线索.     

散发性帕金森病α-synuclein基因突变的检测

目的探讨α-synuclein基因已知突变与散发性帕金森病人的关系.方法分离PD组和对照组的外围血基因组DNA,采用α-synuclein基因特异引物对其第四外显子进行PCR扩增,扩增产物用Tsp45Ⅰ酶切鉴定.结果两组PCR均可扩增出216bp的片段,PCR产物不能被Tsp45Ⅰ酶切.结论α-synuclein基因已知点突变与散发性帕金森病可能无明确关系.     

鸽CDC10 cDNA全序列的克隆与测序

目的　自鸽视盖克隆CDC10全长cDNA。　方法　建立鸽左侧单眼剥夺模型 ,采用cDNA末端快速扩增法和RNA转录物转换机制技术分别克隆鸽CDC10基因的 3′和 5′半分子并进行序列分析。　结果　鸽CDC10cDNA全长为 2 32 9bp ,开放阅读框为 12 5 7bp ,推测编码 4 19个氨基酸残基 ,氨基酸水平与人CDC10有 87%的同源性。结论　鸽CDC10全长cDNA序列的克隆为进一步研究该基因在视觉发育中的作用提供条件     

G蛋白偶联受体激酶2对EGF诱导的cAMP生成的调控

目的研究G蛋白偶联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2）对表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）诱导cAMP生成的调控作用及其可能的机制.方法用放射免疫竞争法测定EGF刺激前后细胞内cAMP浓度.用免疫共沉淀的方法检测GRK2与EGF受体（EGF receptor,EGFR）的相互作用.结果（1）EGF刺激使HEK293细胞内第二信使cAMP的浓度显著升高,约是Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的30%～40%.而过表达GRK2后,EGF刺激诱导的cAMP的浓度升高仅为Forskolin刺激诱导的cAMP浓度升高的不足10%（P＜0.01）,说明过表达GRK2能显著抑制EGF刺激的cAMP的生成.（2）免疫共沉淀实验的结果显示EGF刺激后,EGFR受体免疫沉淀复合物中检测到大量GRK2,说明EGF刺激能诱导EGFR-GRK2复合物的形成.结论GRK2对EGF刺激诱导的第二信使cAMP生成有负反馈调控作用,这种调控作用可能是通过EGF刺激的GRK2与EGFR的相互作用来实现的.     

STCH对多巴胺能神经元保护作用的初步研究

本文通过不同手段探讨了STCH(stress and chaperone)对多巴胺能神经元的作用。采用RT-PCR检测STCH的组织表达模式;采用免疫-激光捕获显微切割技术获得单一多巴胺能神经元,采用RT-PCR检测STCH在中脑不同亚区多巴胺能神经元的表达差异;分别构建STCH过表达pEGFP-N2载体和pSuper-EGFP干扰载体,转染HEK293和SH-SY5Y细胞株,检测细胞对MPP+毒性的反应。结果显示:STCH在海马表达最低,肝脏最高;在中央灰质区的多巴胺能神经元可检测到表达,在黑质区检测不到;将STCH干扰片段转染至HEK293细胞,细胞死亡明显;转染至SH-SY5Y细胞,对细胞生长无明显影响,但细胞形态发生改变;与对照组相比过表达STCH的SH-SY5Y细胞对MPP+毒性有抵抗作用,并能抑制MPP+处理细胞中caspase-12的表达。这些结果提示:STCH对多巴胺能神经元具有潜在的保护作用,其机制可能是通过抑制内质网应激诱导的凋亡途径而实现。该结果为寻找Parkinson病的治疗靶向提供了有益的线索。