利用人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的体外实验

背景：目前临床应用的人工瓣膜,无论机械瓣还是生物瓣都存在着诸如易感染、出血和血栓形成并发症,因瓣口狭窄需再手术等自身难以克服的缺陷。理论上具有生物活性的组织工程心脏瓣膜可克服上述缺点,但种子细胞和瓣膜支架的选取尚存在争议。目的：探讨应用人骨髓基质干细胞及脱细胞猪主动脉瓣支架体外构建组织工程瓣膜的可行性。方法：采用去垢剂一核酸酶消化法处理,去除猪主动脉瓣叶细胞成分,获取施行简单先心病修补患者胸骨来源的骨髓基质干细胞,将其种植于脱细胞猪主动脉瓣支架共培养5d。结果与结论：流式细胞技术证实接种的种子细胞的表面抗原符合人骨髓基质干细胞的特征;光镜及电镜检查证实,猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除,获得完整无细胞的纤维网状支架;瓣叶去细胞前后的生物力学性能无明显变化;种植的人骨髓基质干细胞可在脱细胞猪主动脉瓣支架表面形成一层连续的细胞层;接种的人骨髓基质干细胞有向成纤维细胞分化的趋势。以上结果提示种植人骨髓基质干细胞于脱细胞猪主动脉瓣支架上,可构建出组织工程心脏瓣膜。     

TIMP-3基因转染的血管平滑肌细胞移植对心肌梗死后心脏形态和功能的影响

目的: 观察基质金属蛋白酶组织抑制因子3 (tissue inhibitor-3 of matrix metalloproteinases,TIMP-3)基因转染的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)移植,对大鼠心肌梗死后心脏形态和功能的影响。 方法: 取Wistar大鼠胸主动脉采用组织块贴壁法培养VSMCs。应用脂质体转染技术,将TIMP-3-pcDNA3.0重组质粒瞬时转染至VSMCs。另取雌性Wistar大鼠121只（体质量200～250 g）,其中93只建立急性心肌梗死模型。将存活的84只随机分成A、B、C 3组（每组28只）,即于心肌梗死后3 d,再次开胸并在梗死的心肌中分别注射含有3×106个TIMP-3基因转染的VSMCs（A组）、3×106个VSMCs（B组）或改良Eagle培养基（Dulbeccos modification of Eagles medium Dulbecco,DMEM培养基）（C组）各0.3 ml,121只中剩余的28只大鼠作为正常对照组（D组）,不做任何处置。基因转移4周后,进行超声心动图检测心脏的功能,然后获取心脏标本,计算心脏左室容积(left ventricular volume,LVV)和左室容积指数(left ventricular volume index,LVVI),最后进行心脏组织学观察。 结果: 成功分离、培养了VSMCs,纯度达98%,TIMP-3基因成功转入VSMCs中。基因转移4周,超声心动图检查发现,心脏功能的各项指标A组优于B组和C组,B组优于C组;但A、B、C 3组均差于D组（P均<0.05）。A、B、C和D组心脏LVV分别为(894.4±158.3)mm3、(1 126.5±284.7)mm3、(1 372.8±181.9)mm3和(420.2±39.6)mm3,LVVI分别为(2.957±0.362)mm3/g、(3.604±0.710)mm3/g、(4.538±0.259)mm3/g和(1.009±0.134)mm3/g,A、B、C 3组均明显大于D组,A、B组较C组明显减小,A组较B组明显减小（P均<0.05）。组织学观察显示,C组呈心肌梗死表现,B组梗死心肌内可见成簇的肌细胞,室壁较C组增厚;A组较B、C组梗死区缩小、室壁增厚,D组无异常。 结论: 大鼠心肌梗死后3 d,将TIMP-3基因转染的VSMCs移植入梗死心肌内,可明显改善心脏的形态及功能。     

脊柱手术全麻拔管期3种不同用药方法的观察

目的观察舒芬太尼、舒芬太尼复合氟比洛芬酯及喷他佐辛在脊柱手术全麻拔管期的应用。方法选择ASAⅠ或Ⅱ级全麻下择期行脊柱手术患者60例,随机分为舒芬太尼组(S组)、舒芬太尼复合氟比洛芬酯组(SF组)、喷他佐辛组(P组),每组20例,每组采用相同的麻醉方法。各组于手术结束前25 min分别静脉注射舒芬太尼、舒芬太尼复合氟比洛芬酯、喷他佐辛。记录患者诱导前5 min、拔管前5 min、拔管即刻、拔管后5 min、10 min平均动脉压(MAP)、心率(HR)、动脉血氧饱和度(SpO2)及自主呼吸恢复时间、拔管时间及呼吸抑制、手术后躁动的发生率和疼痛视觉模拟评分(VAS)。结果 3组患者拔管前后心血管反应稳定、手术后躁动的发生率及拔管后VAS比较无显著性差异(P>0.05)。S组术毕清醒、拔管时间和呼吸抑制发生率与P组和SF组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 3种用药方法均能有效减轻围拔管期心血管反应,缓解术后疼痛,降低全麻术后烦躁的发生率,从而提高全麻术后的苏醒质量,但舒芬太尼会延长术毕自主呼吸恢复时间及拔管时间。     

成血管干细胞标志物CD117及VEGFR-2在女性早孕子宫内膜表达变化及与血管形成关系的研究

目的探讨早孕时期成血管干细胞标志物CD117及VEGFR-2在子宫内膜表达变化及与血管形成关系的研究。方法通过CD31染色进行微血管密度(MVD)的定量测定;采用免疫组化S-P法检测早孕内膜组、增殖期内膜组及分泌期内膜组中CD117、VEGFR-2的表达及分布情况,并观察与微血管密度的相关性。结果 CD117增生期和分泌期主要表达于子宫内膜基底层的腺体细胞中,在早孕内膜中主要表达于间质细胞中,早孕内膜中间质表达达到高峰,明显强于增生期或分泌期(P<0.05);VEG-FR-2在各期主要表达于子宫内膜基底层的腺体中,早孕内膜组达高峰,明显强于增生期或分泌期,差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜的上述各种生理类型中,VEGFR-2的表达均与微血管密度(MVD-CD31)正相关。结论相比非孕期子宫内膜,早孕期子宫内膜成血管干细胞标志物CD117及VEGFR-2更高表达。与新生血管形成密切相关。     

标准化大鼠心肌梗死模型的制作

目的 探讨建立标准化大鼠心肌梗死模型的制作方法.方法 大鼠麻醉后,经口腔插管连通动物呼吸机,开胸结扎其冠状动脉.于术后4周静脉注射氯化钾处死大鼠,取出心脏,观察心脏外形及梗死瘢痕,并在进行HE染色后于显微镜下观察其病理变化.结果 此法制作心梗模型的成功率为100%,术后动物存活率为90%左右.术后4周取出的心脏,左心室明显扩大,缺血区心室壁变薄塌陷,颜色比周围心肌浅,心腔内膜纤维化.结论 本实验建立的制作心梗模型的方法 确实有效、简单易行.而本实验建立的标准化心肌模型可进一步用于心室重构机制和治疗方面的研究,甚至对各相关领域研究的相互参考和借鉴都能起到重大作用.     

pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 构建标记有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(hTIMP-1)真核表达质粒pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP,并通过转染大鼠血管平滑肌细胞(SMCs)验证hTIMP-1的表达.方法 将hTIMP-1及编码EGFP的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列通过扩增、酶切、插入pcDNA3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP真核表达质粒;应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入SMCs(pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组).应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测hTIMP-1的表达情况;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性.用空质粒pcDNA3.1转染SMCs(空质粒pcDNA3.1转染组)和未转染质粒的SMCs(未转染组)作为对照.结果 pcDNA3.1/hTIMP-1-EGFP转染组重组质粒转染SMCs后,SMCs生长受到抑制;转染24 h后在荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,SMCs出现646 bp目的基因;Western blotting检测显示,在转染后的血管SMCs中有hTIMP-1表达;明胶酶谱法检测结果显示,MMP-2、MMP-9活性降低;与空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 TIMP-1真核表达质粒的构建和在血管SMCs中的表达,为TIMP-1基因治疗的研究奠定了基础.     

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得心肌分化表型的研究

目的 观察不同浓度条件下,细胞接触对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌细胞(CM)的诱导作用.方法 利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因大鼠的BMSCs与CM以不同比例(1:1、1:10、1:20、1:40)共培养1周,分别采用免疫荧光染色及流式细胞计数分析检测肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、α-sarcomeric actinin和MEF-2C等心肌特异性蛋白,采用膜片钳技术检测分化细胞的电生理功能.结果 在共培养条件下,部分GFP-BMSCs可表达一系列心肌表面标记物,如心肌特异性cTnI蛋白等,且获得心肌分化表型的数量随着CM数量的增加而增加.部分GFP-BMSCs与CM一起同步搏动,并可获得与CM相似的膜电位.结论 细胞接触可诱导BMSCs获得有功能的心肌分化表型,其数量与心肌的数量不同浓度有相对的依赖性,随着心肌数量的增加而增加.     

髂筋膜间隙阻滞在老年股骨粗隆间骨折麻醉中的应用探讨

目的 对髂筋膜间隙阻滞在老年股骨粗隆间骨折患者中的临床麻醉效果予以探讨分析。方法 随机选取2012年3月至2013年4月在郑州市骨科医院接受治疗的40例老年股骨粗隆间骨折患者,对其进行有效分组,分别作为对照组(20)与观察组(20),对对照组患者单纯实施全身麻醉,对观察组患者实施全身麻醉后再加用髂筋膜间隙阻滞进行有效处理,比较两组患者的临床麻醉效果。结果 观察组患者的清醒时间、拔管时间、手术时间、麻醉药物使用量都要显著优于对照组患者,且P<0.05,差异具有统计学意义。结论 将全身麻醉后再加用髂筋膜间隙阻滞进行有效处理应用到老年股骨粗隆间骨折患者的临床麻醉中,具有较好的临床麻醉效果,值得在临床应用中推广。     

基质金属蛋白酶组织抑制因子3基因转染血管平滑肌细胞移植对急性心肌梗死后早期心肌重塑的影响

目的研究基质金属蛋白酶组织抑制因子3（tissue inhibitor-3of matrix metalloproteinases,TIMP-3）基因转染血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）移植,对急性心肌梗死（acute myocardialinfarction,AMI）后早期心脏结构变化的影响,并探讨其可能的机制。方法取Wistar大鼠胸主动脉采用组织块贴壁法培养VSMCs。另取61只Wistar雌性大鼠建立左冠状动脉远端结扎的AMI动物模型,将存活的54只大鼠模型随机分为三组,每组18只。于冠状动脉结扎后立即向缺血部心室壁内注射含有1×10^6个TIMP-3基因转染VSMCs（A组）、1×10^6个VSMCs（B组）或不含细胞的PBS液（C组）各0.5ml。术后1周,进行心脏形态学检测观察大鼠心脏结构变化,免疫组织化学染色验证TIMP-3基因转染VSMCs在缺血心肌中的存活情况,Western blot法测定大鼠缺血心肌TIMP-3蛋白和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9,MMP-9）蛋白的含量。结果成功分离、培养VSMCs,纯度达98%,TIMP-3基因成功转入VSMCs中。术后1周,A组大鼠梗死心肌面积占左室游离壁面积的百分比为28.73%±1.56%,小于B组39.63%±1.84%和C组46.32%±2.16%（P〈0.01）;B组小于C组（P〈0.01）。A组大鼠左室容积指数为5.27±0.21mm3/g,小于B组6.69±0.34mm3/g和C组9.67±0.88mm3/g（P〈0.01）;B组小于C组（P〈0.01）。免疫组织化学染色见TIMP-3基因转染VSMCs被成功植入缺血心肌并在其中存活。Western blot法示A组大鼠缺血心肌TIMP-3蛋白含量为300704.8±3692.8,高于B、C组的195548.8±3014.2及177991.1±2502.1（P〈0.01）;B组高于C组（P〈0.01）。A组MMP-9蛋白含量为594827.4±5708.5,低于B、C组的921461.4±8887.4及1044445.0±8788.6（P〈0.01）;B组低于C组（P〈0.01）。结论将TIMP-3基因转染的VSMCs移植入心肌缺血区可明显抑制AMI后早期心肌重塑。