人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的:克隆人天然颗粒溶素(granulysin,GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体,观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法:提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA,经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列,插入pEGFP-C1质粒,鉴定正确后转染RAW264.7细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白及GLS的表达,采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性.结果:成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA,经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达,表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达,其表达产物具有良好的免疫反应性.     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

同种异型抗原激活并套式PCR法克隆人颗粒溶素Mr 15000与Mr 900O活性片段

目的:采用套式PCR克隆经同种异型抗原激活后的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的颗粒溶素(Granulysin,GLS)Mr 15000与Mr 9000活性片段的编码序列并进行序列测定与分析,为进一步表达纯化该活性片段和研究GLS的免疫杀伤机制奠定基础.方法:抽提经过培养并激活的健康人CTL淋巴细胞总RNA,经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的Mr15000与Mr 9000活性片段的编码序列,插入pET32a( )载体,转化大肠杆菌TOP10,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行测序分析.结果:成功扩增出了包含GLSMr15000与Mr9000活性片段完整编码序列的cDNA,与预期大小相同,PCR、酶切及测序鉴定证明得到了读码框正确的pET32a-Mr 15000与pET32a-Mr 9000重组子.序列分析表明GLS基因编码产物在第119位存在氨基酸多态性.结论:人天然颗粒溶素Mr 15000与Mr 9000活性片段编码序列能够通过以上方法获得和克隆并用于后续研究.     

乙型肝炎新疫菌的发展

乙型肝炎病毒的感染可发展为慢性持续性肝炎,慢性活动性肝炎、肝硬化,肝癌等慢性肝病。成人急性感染后变为持续性感染的占5～15％,在某些地区,如果幼年发生感染则持续性感染可高达9O％以上。据保守的估计,全世界有两亿以上乙型肝炎病毒携带者(约占世界人口的5％),因此需对高危人群进行乙型肝炎的免疫接种。此外,某些地区乙型肝炎病毒的高感染率及围产期传播也     

10-23脱氧核酶及其应用进展

1023脱氧核酶是近年来利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,从而调控相应蛋白的表达,可能成为治疗肿瘤、病毒感染等疾病的新型工具。     

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。     

9ku颗粒溶素活性肽重组减毒沙门菌的构建与表达

目的构建人9ku颗粒溶素(granulysin)的重组减毒沙门菌,并在真核细胞中表达,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR、双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌;重组质粒电转化减毒沙门菌后,将重组菌感染巨噬细胞,以RT-PCR检查颗粒溶素的表达。结果成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素;重组减毒沙门菌感染细胞后,检测到颗粒溶素的表达。结论成功构建含9ku颗粒溶素活性肽基因的重组减毒沙门菌,该菌能成功递呈携带基因在感染细胞内表达。     

结核分枝杆菌复活促进因子B的原核表达、鉴定和纯化

目的:构建结核分枝杆菌复活促进因子B(RpfB)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfB基因(1089bp),然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a( )载体连接,转入大肠杆菌Top10;阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.测序正确后,将重组质粒转化到的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了RpfB蛋白;利用Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,最后对目的蛋白进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致.经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现61KDa处有特异性蛋白条带.结论:成功克隆并构建了RpfB基因的重组表达质粒pET32a( )-RpfBv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

淋球菌营养型与耐药性及质粒的关系

目的 为了解淋球菌的营养型、耐药性及质粒之间的关系.方法 对重庆市收集的83株淋球菌进行营养型、抗生素敏感性和质粒检测.结果 83株菌共分为8个营养型,以Pro-型(51-8%)和Proto型(18-1%)为主.利用琼脂稀释法检测菌株对青霉素、四环素和壮观霉素的敏感性.青霉素耐药株占15.6%,四环素耐药株占70%,壮观霉素耐药株占1-2%.通过快速碱裂解法对其中的44株菌进行质粒检测,70%菌株含24-5Md质粒,80%含2.6Md质粒,66%同时含24-5Md和2.6Md质粒,16%未查到质粒.并发现Pro^-型菌株中青霉素耐药株高于其它营养型(P<0.05),且含24-5Md质粒菌也显著高于其它营养型(P<0.05).含24-5Md+2.6Md质粒菌株中四环素耐药株更常见(P<0.05).检测到1株产青霉素酶淋球菌(PPNG),经质粒消除试验证实其耐药性由4-4Md质粒介导.结论 本研究不仅表明了重庆地区淋球菌营养型、耐药性及质粒的分布状况,而且揭示了它们之间存在一定关系.这将对该地区淋球菌的流行病学调查和淋病防治提供帮助.